Informationen zu Fluoreszenzfarbstoffen und -konjugaten

Die Auswahl der Fluorochrome ist abhängig von:

1. der Einstellung und der Ausstattung des Instrumentes, z.B. Verfügbarkeit von Lichtquellen, Filtersets und Detektionssystemen.

2. dem gewünschten Grad der Farbtrennung bei Mehrfachfluoreszenz-Markierungen: Rhodamin Red-X, Alexa Fluor 594 oder Alexa Fluor 647 geben beispielsweise eine bessere Trennung von Alexa Fluor 488 oder FITC als Cy3.

3. dem Expressiongrad des Antigens: für gering exprimierte Antigene ein leuchtintensiveres Fluorochrom als für stark exprimierte Antigene auswählen.

4. der erforderlichen Sensitivität. So sind Alexa Fluor 488, Cy3, Alexa Fluor 594 und Alexa Fluor 647 leuchtintensiver als FITC, Cy2, TRITC, Rhodamin-Red X, Texas Red und Cy5.

Fluoreszenzkonjugate der Sekundärantikörper

Alle Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch Labs werden immunaffinitätschromatographisch durch Adsorption an agarosegekoppelte Antigene aus Antiseren isoliert. Das patentierte sequentielle Elutionsverfahren (AffiniPure) von Jackson ImmunoResearch Labs sorgt für eine schonende Ablösung der Antikörper vom Antigen, woraus Antikörper mit idealen Bindungseigenschaften resultieren.

Weitere Festphasenadsorptionen an Serumproteine verschiedenster Spezies sowie an IgG, IgM, IgA und IgG-Fragmente eliminieren Kreuzreaktionen und stellen die Ig-spezifische Reaktivität der Sekundärantikörper sicher.

Die Nachweisintensität jedes Fluorochrom-Antikörper-Konjugats hängt außer von den Bindungseigenschaften des Antikörpers von der Helligkeit und Fotostabilität des Farbstoffs sowie dem optimalen Verhältnis von Farbstoffmolekülen pro Antikörper ab. Für die Herstellung von Fluoreszenzkonjugaten mit bestmöglicher Nachweisstärke und minimalem Hintergrund werden daher für jeden Farbstoff molare Sättigungskurven vs. Fluoreszenzintensität, Antikörperaktivität, Hintergrundfärbung u. a. Parametern erstellt und anhand dieser Daten eine optimale Farbstoffkopplung ermöglicht.

Die Fluoreszenzkonjugate von Jackson ImmunoResearch Labs werden gefriergetrocknet in 0,01 M Natriumphosphat / 0,25 M NaCl pH 7,6 mit 15 mg/ml BSA / 0,05 % Natriumazid geliefert. Vor erstmaligem Gebrauch Fluoreszenzkonjugat gemäß Datenblattangaben in Aqua dest. auflösen.

Fluorochrome – Histo-/Cytochemie und Durchflusszytomerie
FluorochomAmax [nm]Emax [nm]FarbeAntikörper-Verdünnung
DyLight 405DyLight 405400421Blau-Violett1:100 - 1:800
BV 421Brilliant Violet 421407421Blau-Violett1:50 - 1:200
AMCAAminomethylcoumarin-Acetat350450Blau1:50 - 1:200
BV 480Brilliant Violet 480436478Blau1:50 - 1:200
Cy2Carbocyanin492510Grün1:50 - 1:200
Alexa 488Alexa Fluor 488493519Grün1:100 - 1:800
FITCFluorescein (-Isothiocyanat)492520Grün1:50 - 1:200
TRITCTetramethylrhodamin550570Orange1:50 - 1:200
Cy3Indocarbocyanin550570Orange1:100 - 1:800
R-PER-Phycoerythrin490/545/566580Orange-Rot1:50 - 1:200
RRXRhodamin Red X570590Orange-Rot1:50 - 1:200
Alexa 594Alexa Fluor 594591614Rot1:100 - 1:800
Texas RedTexas Red596620Rot1:50 - 1:200
APCAllophycocyanin650660Tief-/Infrarot1:50 - 1:200
Alexa 647Alexa Fluor 647651667Tief-/Infrarot1:100 - 1:800
Cy5Indodicarbocyanin650670Tief-/Infrarot1:100 - 1:800
PerCPPeridinin-Chlorophyll482676Tief-/Infrarot1:50 - 1:200
Alexa 680Alexa Fluor 680684702Infrarot1:100 - 1:800
Alexa 700Alexa Fluor 700792803Infrarot1:100 - 1:800

Alexa Fluor®, Rhodamin RedTM-X und Texas Red® sind eingetragene Marken von Life Technologies, Inc.*. Cy™ ist eine Marke von GE Healthcare (Patent 5.268.486). Brilliant Violet™ ist ein Markenzeichen von Sirigen Inc., a Becton, Dickinson and Company affiliate. DyLight™ ist ein Markenzeichen von Thermo Fisher Scientific. Über alle Farbstoffe und deren Farbstoffprodukte besitzt Jackson ImmunoResearch Labs mit den genannten Firmen Lizenzvereinbarungen zu den Farbstoff-Technologien bezüglich Verwendung, Herstellung, Handel und Verkauf.
* Konjugate dieser Farbstoffe sind nicht zur Verwendung für kommerzielle Zwecke (Weiterherstellung, Diagnostik, Therapie, Auftragsbestimmung o. a.) bestimmt. Für Lizenz-Informationen zur Verwendung für andere Zwecke als der Forschung: Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA 92008.

Die früher erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffe Cy2 und DyLight 488 bzw. Cy5 und DyLight 647 sind durch die Farbstoffe Alexa 488 bzw. Alexa 647 ersetzt worden, ebenso wie DyLight 594 durch Alexa 594. Im orangen Emissionsbereich sind die fluoreszenzstarken Cy3-Konjugate von Jackson ImmunoResearch erhältlich.

Alexa Fluor®-Farbstoffe (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 790)

Aminomethylcoumarin-Acetat (AMCA)

Cyanin-Farbstoffe (Cy2™, Cy3™, Cy5™)

DyLight™ -Farbstoffe (DyLight 405)

Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)

Tetramethylrhodamin-Isothiocyanate (TRITC), Rhodamine Red™-X (RRX) und Texas Red® (TR)

R-Phycoerythrin (R-PE), Allophycocyanin (APC) und Peridinin-Chlorophyll (PerCP)

Mehr Informationen zur Mehrfarben-Fluoreszenzmarkierung

 Optimales Eindecken für mehr Fluoreszenzstablität und Signalschärfe

Mounting_ImmunoSelect_Antifade_500_01_eb9544b5c1Um Ausbleichen zu verhindern und die Signalstärke zu erhalten, eignet sich für Mehrfachmarkierungen mit allen Fluoreszenzfarbstoffen als universelles Eindeckmedium  ImmunoSelect® Antifading Mounting Medium. Die Zusammensetzung des Mediums verhindert das häufige Problem der Autofluoreszenz von Eindeckmedien. Durch eine starke Anfangsfluoreszenz, kombiniert mit sehr guten Antifading-Eigenschaften und keinerlei Autofluoreszenz in den relevanten Spektralbereichen garantiert ImmunoSelect® Antifading Mounting Medium klare Signale mit hoher Kontrastschärfe.

Keine Materialverluste bei Färbung seltener Zell- und Gewebeproben

ImmunoSelectAdhesive_Slides_720_091eb28976Wirkungsvolles Immobilisieren von Zell- und Gewebeproben beugt Verlusten wertvollen Probenmaterials durch Wasch- und Färbeschritte vor. Immunoselect® Adhäsionsobjektträger ermöglichen schnelle und starke Haftung von Proben durch einfaches Auftropfen ohne zusätzliche Zentrifugation, Trocknung oder Fixierung. Die neuartige Haftbeschichtung der Objektträger reagiert mit den natürlichen Oberflächenstrukturen von Zellen und Geweben und verankert diese über verschiedene Bindungsprinzipien dauerhaft auf der Glasoberfläche. ImmunoSelect Adhäsionsobjektträger verhindern ein Abschwemmen von Proben unter extremsten Inkubationen bei vollem Erhalt der Antigenität.

  • Blitzschnelles Anheften von Zellen  und Gewebeschnitten mit hohen Ausbeuten > 95%
  • Neuartige Alternative zu Polylysin und anderen Adhäsionsverfahren
  • Keine Cytospins oder Ausstriche notwendig, Zellen auftropfen und absinken lassen
  • Zelladhäsion resistent gegen Hitze, Färbungen und Denaturierung
  • Kein Zellverlust selbst bei harschen zytologischen Färbetechniken
  • Überragender Erhalt der Zell- und Gewebemorphologie

Beispielprotokoll: Vierfach-Immunfluoreszenzmarkierung im Parallelansatz

Vierfachmarkierung der Kalzium-bindenden Proteine Calbindin, Parvalbumin und Calretinin sowie perineuronaler Netze

(nach: Härtig et al. 1996, J. Neurosci. Methods 67: 89-95 und Schwaller et al. 1999, J. Neurosci. Methods 92: 137-144)

Mehrfachmarkierung_479_cff889bf65

Hippocampus der Ratte: A) Biotinyliertes Solanum tuberosum Agglutinin/Alexa Fluor 488-Streptavidin (Gefäße), B) Kaninchen-anti-GFAP/Cy3-Esel-anti-Kaninchen (Astroglia), C) Maus-anti-NeuN/AlexaFluor 647-Esel-anti-Maus (MinX Ratten IgG; neuronale Kerne), D) „Merge“ (W. Härtig, Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Germany)

Die Cytochemie Kalzium-bindender Proteine ist oft eine Methode der Wahl zur Darstellung morphologischer Details immunpositiver Nervenzellen. Mehrfachmarkierungen dieser Marker tragen zur Aufklärung von komplizierten Struktur-Funktions-Beziehungen im Zentralnervensystem bei.

Material: 30 µm-dicke, frei bewegliche Gefrierschnitte von Paraformaldehyd-fixiertem Rattenhirn.*
Hinweis: Die Schnitte werden frei flottierend in Vertiefungen von Mehr-Well-Platten gefärbt/gewaschen und erst nach der Färbung auf Objektträger aufgezogen. Das Transferieren der Schnitte in einzelne Wells erfolgt mit Hilfe eines geeigneten Pinsels.

Alle Schritte bei Raumtemperatur durchführen:

1. 3 x 10 min Waschen des Gewebes mit 0,1 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,4

2. Blocken unspezifischer Bindungsstellen des Gewebes mit 5% Esel-Normalserum (Kat.-Nr. 017-000-121) in TBS + 0,3% Triton X-100 (= ENS-TBS-T); 1 h

3. Inkubation mit einem Cocktail primärer Antikörper und Wisteria floribunda Agglutinin in ENS-TBS-T; 16 h* bei Raumtemperatur:
• Maus-anti-Calbindin [1:200; Klon CL-300; Sigma]
• Kaninchen-anti-Parvalbumin [1:500; Swant]
• Ziege-anti-Calretinin [1:100; Swant]
• Biotinyliertes, reduziertes Wisteria floribunda Agglutinin (20 µg/ml; Sigma)

4. 3 x 10 min Waschen der Schnitte mit TBS

5. Inkubation mit einem Cocktail sekundärer fluorochromierter Antikörper, verdünnt mit TBS (+ 2% Rinderserumalbumin, z.B. Fraktion V)]; 1 h:
• Alexa Fluor 488-Esel-anti-Maus IgG (Kat.-Nr.: 715-545-151; 20 µg/ml)
• Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (711-165-152; 20 µg/ml)
• AMCA-Esel-anti-Ziege IgG (705-155-147; 30 µg/ml)
• Alexa Fluor 647-Streptavidin (016-600-084; 20 µg/ml)

6. 3 x 10 min Waschen der Schnitte mit TBS und mit destilliertem Wasser (1 min)

7. Aufziehen der Schnitte auf fluoreszenzfreie Objektträger; Lufttrocknung

8. Eindecken z.B. mit Entellan (in Toluen; Merck) oder mit einem wässrigen Eindeckmedium.

* Bitte beachten Sie: Dies ist kein Standardprotokoll. Die Inkubationszeit für die Primärantikörper ist abhängig von den Antikörpereigenschaften und der Dicke der Gewebeschnitte. Sie kann von 1 h bis mehreren Stunden bei Raumtemperatur bis zu einigen Tagen bei 4°C variieren.

Immunfluoreszenznachweis-Methoden lassen sich auch an Paraffin- und Kryostatschnitten sowie an Wholemounts durchführen, vorausgesetzt es stehen geeignete Primärantikörper zur Verfügung. Im Anschluss an den Einsatz geeigneter Primärantikörper lassen sich. Zur empfindlichen Darstellung bestimmter, oft Membran-assoziierter Antigene behandelt man die Gewebe während der histochemischen Verfahren mit Detergenzien (häufig verwendet: 0,1-1% Triton X-100, das oft der Blockierlösung für die Primärantikörper zugefügt wird). Weil Triton irreversibel wirkt, reicht sein einmaliger Einsatz während der Versuche und es kann auf seinen Zusatz zu Sekundärantikörpern verzichtet werden. Durch höhere Tritonanteile in Inkubationslösungen, die für verschiedenene immunhistochemische Verfahren eingesetzt werden, können Artefakte wie z.B. Myelinfärbungen auftreten (siehe Weruaga et al. 1998).

Anti-Hapten Konjugate in immunhistologischen Färbungen

Anti-Hapten-Systeme können sehr gut in Mehrfachmarkierungen mit haptenylierten Primärantikörpern eingesetzt werden (Abb. 1). Besonders dann, wenn sich Primärantikörper nicht mit Spezies- oder Subklassen-spezifischen Sekundärantikörper-Konjugaten unterscheiden lassen, garantieren sie eine empfindliche und differenzierte Darstellung der Antigene.

Fluorescein-anti-Fluorescein-Markierungen

Anti-Fluorescein Antikörper bilden neben ihrer besonderen Eignung für Mehrfachmarkierungen eine hervorragende Grundlage für die nachfolgende Signalverstärkung durch Markerenzyme, Fluoreszenz- und Immungold-Markierungen. Ein wesentlicher Vorteil von Fluorescein-anti-Fluorescein Techniken gegenüber anderen Hapten-anti-Hapten-Verfahren sowie (Strept)Avidin-Methoden besteht darin, dass Hapten-Signale detektiert werden können oder ihre Konzentration durch Absorption in Lösung messbar ist, bevor der sekundäre Nachweisschritt folgt. Außerdem kann durch ein auf Fluorescein-anti-Fluorescein basiertes Nachweissystem unerwünschte Hintergrundfärbung zelleigenen Biotins umgangen werden.

Abbildung 1

Abbildung 1

Peroxidase-markierte Antikörper gegen Fluorescein erlauben die Umwandlung des Fluoreszenz-Signals Fluorescein-konjugierter Nachweisreagenzien in ein lichtmikroskopisch sichtbares und elektronendichtes Reaktionsprodukt (Abb. 2). Der Einsatz dieser Konjugate steigert die Nachweisempfindlichkeit erheblich, erfordert aber auch eine sorgfältige Optimierung der Konzentration von Fluorescein-konjugierten Markern. So reicht bereits ein Zehntel der für die Durchflusszytometrie angegebenen Einsatzkonzentration eines Fluorescein-konjugierten CD-Markers, um in einer immunhistochemischen Färbung mit Peroxidase-konjugiertem anti-Fluorescein Antikörper ein deutliches Signal zu erhalten (Abb. 2). Konjugate aus Markerenzymen und anti-Fluorescein Antikörper lassen sich außerdem in ELISAs oder zum Nachweis Fluorescein-markierter Proben auf Blot-Membranen einsetzen.

Abbildung 2 (1* und 2*)

Abbildung 2 (1* und 2*)

Abb. 2: Konvertierung von Fluoreszenz in ein lichtmikroskopisch sichtbares Reaktionsprodukt.(A) Mikroglia in autoptischem corticalen Hirngewebe. Umwandlung der relativ schwachen Fluoreszenz-Markierung mit Fluorescein anti-CD45 durch Peroxidase-markierten anti-Fluorescein Antikörper (#200-032-037) und das Chromogen Nickel-verstärktes Diaminobenzidin (DAB). (B) Perineuronale Netze der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Konversion grünfluoreszierender Lektin-Bindungsstellen für Fluorescein-markiertes Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) durch Peroxidase-konjugierten anti-Fluorescein Antikörper (# 200-032-037) und Nickel-verstärktes DAB.

Abbildung 3

Abbildung 3

Mit Alexa Fluor 488 oder anderen Grünfarbstoffen markierte anti-Fluorescein Antikörper eignen sich dazu, die Grünfluoreszenz des an einen Antikörper, eine Nukleinsäure oder anderen Biomoleküls gekoppelten Haptens Fluorescein zu verstärken, ohne dessen Fluoreszenzfarbe zu ändern (Abb. 3). Fluorescein-gekoppelte Marker sind bei nachträglicher Amplifizierung in einer höheren Verdünnung einsetzbar als ohne Signalverstärkung. Darüber hinaus ist die Alexa Fluor 488-Fluoreszenz weniger empfindlich gegenüber Fading als die des Fluoresceins.

Abb. 3: Verstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein. Perineurales Netz der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Farbverstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein-konjugiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) mit grün-markiertem anti-Fluorescein Antikörper (z.B. #200-542-037).

Abbildung 4

Abbildung 4

Mit leuchtenden Rotfarbstoffen wie Cy3 markiertes anti-Fluorescein kann genutzt werden, um die Grünfluoreszenz eines Fluorescein-Konjugates in eine photostabile Rot-Fluoreszenz umzuwandeln und dadurch das Signal von Fluorescein-Konjugaten zu verstärken (Abb. 4).

Abb. 4: Umwandlung der Grünfluoreszenz in ein stabil rot fluoreszierendes Signal. Doppelmarkierung eines perineuronalen Netzes der extrazellulären Matrix (rot) und Blutgefäßen (blau) im Ratten-Neocortex. Netzdarstellung mit Fluorescein-markiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) gefolgt von Cy3-markiertem anti-Fluorescein Antikörper. Gefäßmarkierung mit biotinyliertem Kartoffel-Lektin (Solanum tuberosum Agglutinin) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084).

Abbildung 5

Abbildung 5

Gemeinsam mit anti-Digoxin oder anti-Biotin (oder Streptavidin) können anti-Fluorescein-Konjugate für Doppel- und Mehrfachfärbungen mit Hapten-konjugierten Markern eingesetzt werden (Abb. 5). Peroxidase-Konjugate von Antikörpern gegen Haptene ermöglichen in CARD-Nachweissystemen im Zusammenspiel mit Fluoreszenz-markierten Tyramid-Derivaten eine erheblich verbesserte Nachweisempfindlichkeit.

Abb. 5: Hapten-anti-Hapten-Mehrfach-Markierung. Dreifachmarkierung von Gefäßen, perineuronalen Netzen der extrazellulären Matrix und Astroglia im Cortex der Ratte. Die Färbung der Blutgefäße (blau) erfolgte mit biotinyliertem Lektin (Solanum tuberosum) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084). Perineuronale Netze (grün) wurden mit Fluorescein-markiertem Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) und nachfolgend grün-markiertem anti-Fluorescein (z.B. # 200-542-156) dargestellt, während digoxigenyliertes anti-GFAP und Cy3-konjugiertes anti-Digoxin (200-162-156) der Detektion von Astroglia diente.

> Liste der anti-Hapten-Konjugate für immunhistologische Markierungen

> Literatur – Anwendungsbeispiele

Abbildungsnachweis: (*1) Alle abgebildeten Präparate stammen von Wolfgang Härtig aus dem Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung (PFI) der Universität Leipzig. Die Abbildungen von Fluoreszenzmarkierungen wurden an einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM) 510 Meta von Jens Grosche (PFI) angefertigt. (*2) Die Aufnahmen der Immunperoxidase-Markierungen erfolgten durch Uli Gärtner (PFI) an einem Axiophot, ausgestattet mit einer AxioCam HRC sowie dem Programm AxioVision 3.1.2.1.