Fluoreszenzfarbstoffe

Alexa Fluor®-Farbstoffe

Alexa Fluor®-Farbstoffe ergeben Konjugate mit hoher, den meisten herkömmlichen Fluoreszenzfarbstoffen überlegener Leuchtkraft und Fotostabilität. Durch ihr hohes Absorptionsvermögen bei Wellenlängen gängiger Anregungsquellen mit maximaler Anregung und ihre geringe Tendenz zur Selbstlöschung der Fluoreszenz nach Kopplung an Proteine produzieren Biokonjugate von Alexa Fluor eine helle und außergewöhnlich stabile Fluoreszenz. Die Fluoreszenzintensität ist unempfindlich gegenüber Schwankungen des pH-Wertes in einem breiten Bereich. Die gute Wasserlöslichkeit der Farbstoffe macht die Biokonjugate widerstandsfähig gegen Aggregation und Präzipitation, was Probleme mit Hintergrundfärbung verhindert. Alexa Fluor-Farbstoffe sind aufgrund struktureller Ähnlichkeiten mit den DyLight-Farbstoffen eng verwandt.

Alexa Fluor 488 (Amax 493 nm, Emax 519 nm) besitzt mit Fluorescein (FITC) vergleichbare Spektraleigenschaften hinsichtlich Anregung und Emission, produziert jedoch Konjugate, die weit fluoreszenzintensiver, fotostabiler und unempfindlicher gegenüber pH-Schwankungen zwischen pH 4 und 10 sind. Alexa Fluor 488-Konjugate sind mit für Fluorescein üblichen Geräteausstattungen, Einstellungen oder Filtern kompatibel und eignen sich ideal für alle fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Anwendungen mit höchsten Sensitivitäts-Ansprüchen. Alexa Fluor 488 kann im Epifluoreszenzmikroskop länger sichtbar gemacht werden und heller erscheinen als Fluorescein, auch ohne die Zugabe von Anti-Fading Agenzien in wässrige Eindeckmittel. Auch in dauerhaften organischen Eindeckmitteln ist Alexa Fluor 488 leuchtstärker und langzeitstabiler als Fluorescein. Alexa Fluor 488 ist vergleichbar mit DyLight 488.

Alexa Fluor 594-Konjugate (Amax 591 nm, Emax 614 nm) fluoreszieren im roten Bereich des Lichtspektrums, sind leuchtintensiver als andere rot fluoreszierenden Farbstoff-Konjugate und liefern eine deutlich bessere Farbtrennung von grünen Fluoreszenzfarbstoffen als Alexa Fluor 549, Cy3 oder TRITC. Daher sind sie die beste Wahl für Immunfluoreszenz-Nachweise im dunkleren Rotbereich des sichtbaren Spektrums. Alexa Fluor 594-Konjugate fluoreszieren wesentlich stärker und stabiler als Texas Red-Konjugate, sind besser wasserlöslich und verursachen weniger Hintergrundfärbung. Die Fotostabilität ist jedoch auch vom Eindeckmedium abhängig: während Alexa Fluor 594-Konjugate in ProLong® Gold Antifade (Life Technologies) stabiler als Texas Red-Konjugate sind, bleichen sie in VECTASHIELD® (Vector Laboratories) schneller aus.

Alexa Fluor 647-Konjugate (Amax 651 nm, Emax 667 nm) entsprechen in ihren Spektraleigenschaften nahezu denen von Cy5-Konjugaten, sind jedoch wesentlich heller als diese. Wenn im nahen Infrarot-Bereich fluoreszierende Sekundärantikörper eingesetzt werden sollen, sind Alexa Fluor 647-Konjugate die beste Wahl für die konfokale Lasermikroskopie und eine vergleichbare oder sogar bessere Alternative zu APC-Konjugaten für die Durchflusszytometrie.
Alexa Fluor 647-Konjugate können aufgrund des weiten Abstands ihrer Emission von anderen, bei kürzeren Wellenlängen emittierenden Fluorochromen mit vielen anderen Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert und hervorragend für Mehrfachmarkierungen in der konfokalen Lasermikroskopie eingesetzt werden. Ein besonderer Vorteil von Alexa Fluor 647 gegenüber anderen Fluoreszenzfarbstoffen ist die bei Anregung mit rotem Licht resultierende niedrige Autofluoreszenz biologischer Proben.
Da die Fluoreszenz bei 670 nm mit dem menschlichen Auge nicht ausreichend wahrgenommen werden kann, kann Alexa Fluor 647 mit einem konventionellen Epifluoreszenzmikroskop nicht optimal bzw. kaum sichtbar gemacht werden, zumal die Quecksilberlampe, die in den meisten Geräten verwendet wird, nicht genügend Licht innerhalb des Anregungsbereiches von Alexa Fluor 647 emittiert. Alexa Fluor 647-Konjugate werden daher nicht für die Verwendung in der Epifluoreszenzmikroskopie empfohlen. Sie werden meist durch mit einem geeigneten Anregungs-Laser (Helium-Neon-Laser (bei 633 nm), Krypton-Ionen-Laser (bei 647 nm), Diodenlaser) und Infrarot-Detektor sichtbar gemacht.
Für die Durchflusszytometrie stellen Alexa Fluor 647-Konjugate eine günstige und in ihrer Fluoreszenzintensität vergleichbare bis bessere Alternative zu APC-Konjugaten dar. Durch die geringere Molekülgröße von Alexa Fluor 647 (1,3 kDa) im Vergleich zu APC (104 kDa) sind die resultierenden Antikörper-Konjugate von Alexa Fluor 647 außerdem wesentlich kleiner und besser für intrazelluläre Markierungen in der Durchflusszytometrie geeignet.

AMCA (Aminomethylcoumarin-Acetat)

AMCA-Konjugate werden aufgrund ihrer spektralen Eigenschaften (Amax 350 nm, Emax 450 nm) zumeist überwiegend für Mehrfachmarkierungen sowohl in der Immunfluoreszenz-Mikroskopie als auch in der Durchflusszytometrie eingesetzt. Sie zeigen wenig Fluoreszenzüberlappungen mit grün fluoreszierenden Farbstoffen und kaum oder gar keine mit länger wellig emittierenden Fluorochromen. Aufgrund seiner kritischen optischen Eigenschaften wird AMCA nicht für Einzelmarkierungen empfohlen.
Wird dieser blaue Fluoreszenzfarbstoff bei Mehrfachmarkierungen in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, sollte das am stärksten exprimierte Antigen mit ihm nachgewiesen werden, da das menschlichen Auge diese Farbe schlechter wahrnimmt als andere Farben. Dabei kann AMCA mit einer Quecksilberlampe angeregt und die Fluoreszenz bei Verwendung eines UV-Filtersatzes betrachtet werden. Möglichkeiten die Sichtbarkeit von AMCA zu verbessern, umfassen die Dunkelanpassung der Augen, die Verwendung von Fluorit- anstelle von Glasobjektiven, die Vermeidung von UV-Licht absorbierenden Eindeckmitteln (z. B. Plastik-basierte Medien) und die Aufnahme fotografischer Bilder mit einem blaulicht-empfindlichen Film oder CCD-Kameras.
Wegen der ungünstigen Ausbleicheigenschaften von AMCA in der konfokalen und konventionellen Fluoreszenz-Mikroskopie empfiehlt sich die Zugabe von Antifading-Reagenzien wie z. B. n-Propylgallat (2 % n-Propylgallat in handelsüblichen Eindeckmitteln oder in 80-90 % Glycerol in PBS (pH 7,2 – 9,0)).
In der Durchflusszytometrie kann AMCA mit einer Quecksilberdampflampe oder einem wassergekühlten Argonionen-Laser, der Emissionswellenlängen im UV-Bereich besitzt, angeregt werden.
Wegen des relativ schwachen Signal und des schnellen Ausbleichen wird AMCA nicht für die Einphotonen induzierte Fluoreszenzmikroskopie empfohlen. Allerdings hat sich AMCA für die Zweiphotonen-Mikroskopie als signalintensiv und fotostabil erwiesen (Dr. Brian Matsumoto, UC Santa Barbara).

Cyanin (Cy™)-Farbstoffe

Cy2™ (Amax 492 nm, Emax 510 nm), Cy3™ (Amax 550 nm, Emax 570 nm) und Cy5 (Amax 650 nm, Emax 670 nm) gehören zu einer Fluorochrom-Familie der zweiten Generation. Sie sind photostabiler und leuchtintensiver als zum Beispiel FITC oder TRITC. Während Cy3-Konjugate aufgrund ihrer besonderen Leuchtkraft und Fotostabilität durchgängig erhältlich waren, hatte der Hersteller Jackson ImmunoResearch die Produktion von Cy2- und Cy5- Konjugaten eingestellt und durch die leuchtstärkeren Farbstoffe Alexa Fluor® ersetzt.
In verschiedenen Laboren wurde nun gezeigt, dass generell alle Cyanine bei Verwendung von organischen Eindeckmitteln und der damit einhergehenden starken Dehydrierung beim Einbettprozess  zu besseren Färbeergebnissen führen.
Jackson ImmunoResearch hat deshalb  ausgewählte  Cy2- und Cy5-Konjugate, konjugiertes Streptavidin und konjugierte IgG Kontrollen – insbesondere für die Mehrfachmarkierung – wieder in das Programm aufgenommen.
Cy2™ (Carbocyanin) hat ähnliche spektrale Eigenschaften wie FITC und kann mit den gleichen Filtersets dargestellt werden. Beim Einsatz von Antifading-Reagenzien ist zu beachten, dass es sensitiv gegenüber N-Phenylendiamin ist, das in einigen kommerziellen Antifading-Medien vorkommt.

Cy3™ (Indocarbocyanin) ist leuchtstärker, fotostabiler und zeigt weniger Hintergrund als TRITC und die meisten anderen Fluoreszenzfarbstoffe. Cy3-Konjugate können ohne apparativen Mehraufwand mit einem konventionellen TRITC-Filtersatz verwendet werden, da die Anregungs- und Emissionsspektren mit denen von Tetramethylrhodamin (TRITC) nahezu identisch sind. Spezielle Cy3-Filter (z.B. Fa. Zeiss Filtersatz 20) sind ebenfalls von verschiedenen Anbietern erhältlich. Cy3 kann zu 50% seiner Maximalabsorption mit den 514 nm- oder 528 nm-Strahlen eines Argon-Lasers angeregt werden, zu 75% des Maximums mit einem Helium-Neon-Laser (bei 543 nm) oder mit einer Quecksilberlampe (bei 546 nm).
Cy3 wird häufig mit einem im grünen Spektrum fluoreszierenden Farbstoff für Doppelmarkierungen eingesetzt. Wegen der spektralen Überlappung der Fluoreszenzemission ist zur Minimierung der Cy3-Fluoreszenz im Filtersatz des Grünfarbstoffs allerdings die Verwendung eines engen Bandpassfilters für den grünen Kanal empfehlenswert. Steht ein konfokales Mikroskop mit einem Krypton-Argon-Laser und einem Infrarot-Detektor (CCD) zur Verfügung, kann Cy3 für Mehrfachmarkierungen auch mit Farbstoffen im nahen Infrarotbereich wie Alexa Fluor 647 kombiniert werden.

Cy5™ (Indodicarbocyanin) eignet sich wegen seiner minimalen Überlappung zu anderen Fluorochromen vor allem für Mehrfachmarkierungen.
Da die Fluoreszenz von Cy5 mit dem menschlichen Auge nicht ausreichend wahrgenommen werden kann, kann Cy5 mit einem konventionellen Epifluoreszenzmikroskop nicht optimal bzw. kaum sichtbar gemacht werden, zumal die Quecksilberlampe, die in den meisten Geräten verwendet wird, nicht genügend Licht innerhalb des Anregungsbereiches von Cy5 emittiert.
Cy5 kann durch einen Krypton/ Argon-Laser (98% der Maximalabsorption mit 647 nm Wellenlänge), einem Helium/Neon-Laser (63% der Maximalabsorption mit 633 nm Wellenlänge) oder mit einem roten Dioden-Laser angeregt werden.

DyLight™ -Farbstoffe (DyLight 405)

DyLight™-Farbstoffe gehören zu einer den Alexa-Farbstoffen vergleichbaren Familie von Fluorochromen mit verbesserter Helligkeit und Fotostabilität. Sie sind hochgradig wasserlöslich und behalten ihre Leuchtkraft in einem pH-Bereich von 4 bis 9.

DyLight 405-konjugierte Antikörper (Amax 400nm, Emax 421nm) sind sehr hell und fotostabil, jedoch ist ihr Einsatz auf konfokale Mikroskope mit einem 405 nm-Laser und geeignetem Emissionsfilter beschränkt. Hier kann DyLight 405 sowohl in wässrigen als auch in permanenten Eindeckmedien mit hoher Farbtrennung und Sensitivität wirkungsvoll für Vierfarben-Imaging im blauen Bereich eingesetzt werden. In Kombination mit Alexa 488, Rhodamin Red-X und Alexa 647 lässt sich die beste Farbtrennung erzielen.
Bei einer etwas geringeren Farbtrennung ist der Einsatz von Cy3 anstelle von Rhodamin Red-X ebenfalls möglich. Bei Verwendung wässriger Eindeckmedien empfiehlt sich der Zusatz von n-Propylgallat gegen das Ausbleichen der Fluoreszenz (Eindeckmedium z. B. n-Propylgallat-Glycerol).
Der Einsatz von DyLight 405 in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie sowie in der Durchflusszytometrie wird nicht empfohlen, da hier die optimalen Filtersets/Anregungsquellen meist nicht vorhanden sind.

FITC (Fluorescein-Isothiocyanat)

FITC (Amax 492 nm, Emax 520 nm) ist ein Fluoresceinderivat, welches aufgrund seiner langen Geschichte auch heute noch häufig eingesetzt wird. FITC ist die Fluorescein-Form, die mit Ausnahme von Streptavidin an alle Antikörper und Proteine von Jackson ImmunoResearch Labs gekoppelt ist. Zu den schwerwiegensten Nachteilen gehört das schnelle Ausbleichen (Fading) und die im Verhältnis zu neueren Fluorophoren geringe Leuchtkraft. Wegen der ungünstigen Ausbleicheigenschaften empfiehlt sich beim Einsatz von FITC-konjugierten Antikörpern die Zugabe von Antifading-Reagenzien.

DTAF (Dichlorotriazinylamino-Fluorescein) und FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) sind Derivate desselben Fluoresceinmoleküls, weshalb DATF identische Anregungs- und Emissionmaxima wie FITC besitzt. Zur Kopplung an Streptavidin verwendet Jackson ImmunoResearch Labs DTAF anstelle von FITC, da die Fluoreszenz von FITC nach Kopplung an Streptavidin erheblich gelöscht wird (Effekt der Fluoreszenzlöschung/ Quenching-Effekt). Dieses Phänomen ist einzigartig für Streptavidin und wird bei Kopplung an Antikörper nicht beobachtet..

TRITC, Rhodamin Red™-X und Texas Red®

TRITC, Rhodamin Red-X und Texas Red sind Rhodaminderivate, die im orangen bzw. roten Bereich des sichtbaren Spektrums fluoreszieren. Konjugate dieser Rhodamin-Farbstoffe besitzen jeweils verschiedene Anregungsmaxima (550, 570 und 596 nm) und Emissionsmaxima (570, 590 und 620 nm). Alle drei Fluorochrome sind für Doppelmarkierungen in Kombination mit FITC oder Alexa Fluor 488 geeignet.
Obwohl in Doppelmarkierungen traditionell meist TRITC mit FITC kombiniert worden ist, lässt sich mit Rhodamin Red-X oder Texas Red wegen der geringeren Überlappung mit dem FITC-Spektrum eine bessere Farbtrennung erzielen (Titus et al., J. Immunol. Methods. 1982, 50, 193). Allerdings ist beschrieben worden, dass die Verwendung von Texas Red zu höherer Hintergrundfärbung führen kann (Wessendorf und Brelje, Histochemistry. 1992, 98, 81). Als hintergrundärmere, hellere und stabilere Alternative zu Texas Red empfiehlt sich die Verwendung von Alexa Fluor 594-Konjugaten. Ebenso stellt Cy3 eine leuchtstärkere Alternative zu TRITC dar.
Zur Doppelmarkierung mit FITC in der Durchflusszytometrie wird Phycoerythrin (anstelle von Rhodamin) empfohlen, da beide Fluorophore mit einem Argon-Laser (488 nm) angeregt werden können.

Rhodamin Red-X (Rhod. Red-X, RRX) ist wegen seiner spektralen Eigenschaften ein nahezu ideales Fluorochrom für Drei- und Vierfachmarkierungen mit DyLight 405, Alexa Fluor 488, und Alexa Fluor 647 bei Verwendung eines mit einem 405 nm-Laser und einem Krypton-Argon-Laser ausgestatten konfokalen Lasermikroskops.
Die Fluoreszenzemission von Rhodamin Red-X liegt ungefähr mittig zwischen der von Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 647 und zeigt nur wenig Überlappung mit diesen Farbstoffen. Außerdem können alle drei Fluorochrome durch den bei konfokalen Lasermikroskopen meist vorhandenen Krypton-Argon-Laser ohne relevanten Empfindlichkeitsverlust detektiert werden, da die emittierten Laserstrahlen bei 488 nm, 568 nm und 647 nm Wellenlänge jeweils die optimalen Anregungswellenlänge für Alexa Fluor 488 (FITC), Rhodamin Red-X und Alexa Fluor 647 darstellen. Durch das Aufschalten eines 405 nm-Lasers wird die Vierfarbenmarkierung mit DyLight 405-konjugierten Sekundärantikörpern möglich.
In der konventionelle Fluoreszenzmikroskopie sind Rhodamin Red-X-Konjugate besonders zur Kombination mit grün fluoreszierenden Farbstoffen (Alexa Fluor 488) geeignet. Möglich ist auch der simultane Einsatz Rhodamin Red-X -gekoppelter Antikörper mit blau fluoreszierenden AMCA-Konjugaten für Doppelmarkierungen.

R-Phycoerythrin (R-PE), Allophycocyanin (APC) und Peridinin-Chlorophyll (PerCP)

R-PE (240 kDa), APC (104 kDa) und PerCP (35 kDa) gehören zu den lichtsammelnden Phycobiliproteinen, einer Familie natürlich auftretender, fluoreszierender Makromoleküle aus den Photosynthese-Systemen verschiedener Algen. Da Phycobiliproteine mehr als 30 kovalent gebundene Tetrapyrrol-Pigmente, sogenannte Phytochromobiline, besitzen, sind die Fluroeszenzsignale besonders intensiv. In den Photosynthese-Systemen der Algen dienen diese Moleküle der Absorption und Weiterleitung von Licht(-energie) durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) an das Chlorophyll der photosynthetischen Reaktionszentren. Die Anordnung der Pigmente im Protein ist natürlicherweise so optimiert, dass maximale Lichtsammlung und Fluoreszenz bei minimaler Fluoreszenzlöschung durch innere oder äußere Umgebungseinflüsse erzielt werden können.

Nach der Konjugation der Phycobiliproteine an die hochaufgereinigten Sekundärantikörper ist die Fluoreszenzlöschung (quenching) im Gegensatz zu konventionellen Flurophor-Antikörper-Konjugationen deshalb sehr gering.
Antikörper-Konjugate mit Phycobiliproteinen besitzen eine sehr hohe spezifische Fluoreszenzaktivität bei hohen Extinktionskoeffizienten und somit eine sehr hohe Quantenausbeute (quantum yield). Die Fluoreszenz einiger Phycobiliproteine entspricht etwa der von 30 Fluorescein- bzw. 100 Rhodamin-Molekülen bei einer vergleichbaren Anregung. Phycobiliprotein-Konjugate lassen sich über einen breiten Wellenlängenbereich anregen und zeichnen durch große Stokes-Verschiebungen ihrer Emissionsmaxima in langwelligere Bereiche aus. Weitere Vorteile von Antikörper-Konjugaten mit Phycobiliproteinen sind deren hohe Stabilität, eine gute Wasserlöslichkeit und eine hohe pH-Unempfindlichkeit der Fluoreszenz. Diese Eigenschaften, zusammen mit der hohen Fluoreszenzintensität, haben sich besonders in auf Laser-Anregung basierenden Techniken wie der Durchflusszytometrie bewährt.

PerCP, Alexa Fluor 488 (oder FITC) und R-PE werden mit der 488 nm-Hauptlinie eines Argon-Lasers angeregt und können so für Einfach-, Doppel- oder Dreifachfärbungen mit Einzellaser-Durchflusszytometern verwendet werden. APC oder auch Alexa Fluor 647 können durch Anregung bei 633 oder 635 nm mit einem Doppellaser-Durchflusszytometer als vierte Farbe eingesetzt werden.

Es sei darauf hingewiesen, dass die relativ hohen Molekulargewichte von R-PE, APC und PerCP ihre Verwendung in Verfahren, die eine gute Durchdringung von Zellen und Geweben erfordern, nur eingeschränkt zulassen. Sie sind überwiegend zur Oberflächenmarkierung von Zellen in der Durchflusszytometrie vorgesehen.

R-PE wird aus makrophytischen Algen (seaweed) isoliert, APC aus blau-grünen Spirulina-Algen und wird zur Stabilisierung chemisch vernetzt. R-PE und APC können durch Licht eines breiten Bereich des sichtbaren Spektrums angeregt werden, sind hochgradig wasserlöslich, haben relativ niedrige isoelektrische Punkte und sind frei von potentiell klebrigen Kohlenhydraten. R-PE besitzt sein Absorptionsmaxim bei 490 mit einem kleineren Adsorptionspeak bei 545/566 nm und emittiert Licht maximaler Fluoreszenz bei 580 nm, während APC bei 650 nm maximal angeregt wird und maximale Emssion bei 660 nm zeigt. R-PE und APC sind besonders für Anwendungen, die entweder eine hohe Sensitivität, eine gute Farbtrennung oder eine Mehrfachmarkierung erfordern, geeignet.

PerCP
ist ein aus Dinoflagellaten (Dinophyceae sp.) gewonnener Peridinin-Chlorophyll-Komplex von ca. 35,5 kD. Es hat ein breites Anregungsspektrum mit einem Hauptabsorptionspeak bei 482 nm, einem zweiten Absorptionspeak bei 442 nm und einer langen Stokes-Verschiebung zu einem Emissionsmaximum bei 677 nm.