Beispielprotokoll Blockieren von endogenen Immunglobulinen mit Fab-Fragmenten auf Mausgewebe

Probenmaterial vorbereiten: Paraffinschnitte hydrieren und Antigendemaskierung nach Herstellerangaben für den Primärantikörper durchführen, Gefrierschnitte fixieren und in Puffer waschen, Zellen in Puffer waschen, fixieren und nochmals waschen.

Waschen: 2 x 5 Minuten mit TBS.

  1. Optional: Gewebeschnitte durch Inkubation mit 1% TX-100 in TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorreinigen.
  2. Beseitigung endogener Peroxidaseaktivität in 0,6% H2O2 in TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
    Hinweis: alternativ gebrauchsfertige Peroxidase-Blockierungslösung von dianova verwenden (ACA500(IVD), ACA999(IVD)).
  3. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  4. Blockierung mit Normalserum: Inkubation der Zellen / Schnitte mit 5% Normalserum in TBS (+ 0,3% TX-100) für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindungsstellen für nachfolgend eingesetzten Antikörper zu blockieren.
    Hinweis: Normalserum aus derselben Spezies wie die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers (z. B. Ziegenserum, Kat.-Nr. 005-000-121).
  5. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  6. Blockierung endogener Maus-Immunglobuline: Zellen / Schnitte mit 20µg – 100 µg/ml unkonjugierten Fab-Fragmenten anti-Maus IgG (H+L) in TBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: 1. Fab-Fragmente aus derselben Spezies wie die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers (z. B. Fab Ziege anti-Maus IgG (H+L), Kat.-Nr. 115-007-003). 2. Die Blockierungseffizienz kann über die Konzentration der Fab-Fragmente und über die Inkubationszeit (2 Stunden bei Raumtemperatur oder Übernachtinkubation bei 4°C) erhöht werden.
  7. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  8. Primärantikörper-Inkubation: Zellen / Schnitte mit nach Herstellerangaben verdünntem Maus-Primärantikörper für 30 – 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Verdünnung in TBS/1%BSA oder in Normalserum-Blockierungslösung (5.).
  9. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  10. Sekundärantikörper-Inkubation: Zellen / Gewebeschnitte mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper in TBS entsprechend Verdünnungsempfehlung des Herstellers (ca. 0,2 – 2 µg/ml) für 30 – 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (z. B. Ziege anti-Maus IgG (H+L), Kat.-Nr. 115-035-062, 115-035-146, 115-035-166).
  11. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  12. Substrat-Inkubation: für 3 – 7 Minuten in der Substratlösung (z. B. DAB) bei Raumtemperatur inkubieren (Kat.-Nr. ACH500 (IVD), ACT500 (High Contrast, IVD).
  13. In Leitungswasser spülen.
  14. Mit Hämatoxylin gegenfärben, falls erwünscht (Kat.-Nr. HAQ500).
  15. In destilliertem Wasser 3 x 5 Minuten spülen.
  16. Lufttrocknen lassen und mit permanentem Eindeckmedium eindecken (Kat.-Nr. PMT030).
Hinweise:
  1. Statt TBS als Puffer für Blockierungs-, Wasch- und Antikörperverdünnungslösung kann auch PBS eingesetzt werden. TBS kann für einen geringeren Hintergrund vorteilhafter sein als PBS.
  2. Eine Hintergrundfärbung von Probenmaterial kann nicht nur eine Ursache haben. So können u. a. auch endogene Peroxidase-Aktivität im Probengewebe oder Fc-Rezeptoren einen Einfluss haben. Peroxidase-Aktivität wird durch einen Blockierungsschritt vor der Blockierung mit Normalserum oder nach der Primärantikörperinkubation inhibiert. Die Bindung des Sekundärantikörpers an Fc-Rezeptoren von Zellen und Geweben lässt sich einerseits durch eine geeignete Blockierung mit Normalserum oder speziellen Fc-Rezeptor-Blockierungslösungen verhindern, andererseits durch die Verwendung von F(ab’)2-Fragment-Sekundärantikörpern (z. B. in Schritt 11. F(ab’)2 Ziege anti-Maus IgG(H+L), Kat.-Nr. 115-036-062).