Allgemeine Empfehlungen zur Verwendung von Sekundärantikörpern im Western Blot

1. Kontrollen

Um spezifische von unspezifischen Banden des Probenmaterials abzugrenzen, grundsätzlich bei jedem Blot eine Kontrolle mitlaufen lassen, in der nur Sekundärantikörper-Konjugat ohne Primärantikörper aufgetragen wurde.

2. Sekundärantikörper-Verdünnung

Der Sekundärantikörper sollte nicht zu hoch konzentriert eingesetzt werden, da dies die Entstehung unspezifischer Hintergrundbindung begünstigt. In den meisten Anwendungen kann der Sekundärantikörper weit über 1:10.000 verdünnt werden, bei ECL sogar doppelt so hoch wie bei Verwendung von Farbsubstraten. Die optimale Verdünnung variiert außerdem zwischen verschiedenen Chargen.

Empfohlene Verdünnungen für Western Blot:

HRPO-Konjugate: 1:5.000 – 1:100.000 (keine ECL) / 1:10.000 – 1:200.000 (ECL)
Alk. Phos.-Konjugate: 1:5.000 – 1:50.000
Biotin-Konjugate: 1:20.000 – 1:400.000
Streptavidin-HRPO: 0,01 – 0,1 µg/ml
Streptavidin-Alk.Phos.: 1 – 2 µg/ml

3. Achtung bei Verwendung von bovinem Milchpulver

Oft wird zur Blockierung von Blots bovines Milchpulver eingesetzt. Manchmal kann auch dies die Quelle unerwünschten Hintergrunds sein.
Um eine Hintergrundreaktion des Sekundärantikörpers mit bovinen Ig im Milchpulver zu vermeiden, ist grundsätzlich die Verwendung von Sekundärantikörpern vorteilhaft, die gegen bovine (MinX Bo) oder humane (MinX Hu) Ig/ Serumproteine adsorbiert wurden.

Weitere Maßnahmen zur Reduktion unspezifischen Hintergrunds sind die Blockierung mit 5% Normalserum aus derselben Spezies wie der Sekundärantikörper oder die Verwendung von IgG-freiem BSA (Kat.-Nr. 001-000-161/2) zum Blocken. Bei problematischen Blots bringt eine Normalserum-Blockierung als einfache Maßnahme oft die saubersten Ergebnisse.

Generell sollte der Sekundärantikörper nur in Puffer ohne Proteinzusatz wie Milchpulver o. a. verdünnt werden, um Reaktionen des Sekundärantikörpers mit Proteinen oder Immunglobulinen im Proteinzusatz auszuschließen. Dies gilt insbesondere für anti-Ziege Konjugate (siehe 4.).

4. Achtung bei Verwendung von Anti-Ziege Konjugaten

Anti-Ziege Sekundärantikörper aus den Wirtsspezies Esel, Kaninchen und Maus reagieren zu einem hohen Grad mit bovinen Immunglobulinen, z. B. in Milchpulver, kreuz. Ist Milchpulver im Sekundärantikörper-Verdünnungspuffer enthalten, kann anti-Ziege Konjugat bereits im Verdünnungspuffer durch bovines Ig „adsorbiert“ werden. Das Konjugat liefert entweder gar kein oder nur in sehr hohen Konzentrationen ein Signal. Außerdem kann es bei diesen Konjugaten zu Hintergrund auf dem Blot kommen, wenn bovines Milchpulver zum Blocken verwendet wurde.

Für den Nachweis von Ziege-Primärantikörpern im Western Blot empfehlen wir daher Rind anti-Ziege (Kat.-Nr. 805-xx5-180). Dadurch, dass der Sekundärantikörper in der sehr nah verwandten Spezies Rind hergestellt wurde, weist er keine Kreuzreaktion mit Rind-Ig / Serumproteinen auf.

5. Endogene Immunglobuline im Probenlysat

Handelt es sich bei der über das Gel aufgetrennten Probe um ein Lysat von Immunglobulin-haltigen Zellen oder Geweben, so sollten Sekundärantikörper ohne Kreuzreaktion (MinX) zur Spezies, aus der das Probengewebe stammt, zum Einsatz kommen. (Alternativ kann dem Verdünnungspuffer des Sekundärantikörpers behelfsweise Normalserum (Ig) derselben Spezies, aus der das Probenmaterial stammt, zugesetzt werden.)

6. Antikörper-Hintergrundbanden bei Immunpräzipitation

Wie Hintergrundbanden durch präzipitierte Immunglobuline beim indirekten Nachweis mit Sekundärantikörpern vermieden werden können, lesen Sie im folgenden Punkt.

Immunoblot (Western Blot) – Vermeidung von Antikörper-Hintergrundbanden

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Eines der häufigsten Probleme im Immunoblot (Western Blot) bei indirektem Nachweis mittels Sekundärantikörpern sind Hintergrundbanden aufgrund von Antikörpern in der aufgetrennten Probe, z. B. durch eine vorherige Immunpräzipitation, durch zell- oder gewebeeigene Immunglobuline im Lysat oder durch Verunreinigungen boviner Immunglobuline (FCS in Zelllysaten, BSA u.a.). In reduzierenden SDS-PAGE-Gelen bilden die aus der Probe eluierten schweren und leichten Ketten von Antikörpern Banden bei 50 kDa und 25 kDa. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen bilden Gamma-Immunglobuline (IgG) eine Bande bei ca. 150 kDa.

Antibody_heavy___light_chain_in_WB_02_78008264cbAm wichtigsten ist die Beachtung dieses Problems bei Immunpräzipitationen (IP), vor allem, wenn die Bande des Zielproteins in diesen Molekulargewichtsbereichen erwartet wird.

Durch die Verwendung direkt markierter Primärantikörper zum Nachweis des Zielproteins auf dem Blot kann das Problem von Antikörper-Hintergrundbanden bei IP komplett umgangen werden. Oft steht jedoch kein Primärantikörper-Konjugat zur Verfügung, so dass ein unkonjugierter Primärantikörper mit einem Sekundärantikörper-Konjugat markiert werden muss.

Eine Möglichkeit, unerwünschte Banden des zur IP verwendeten Antikörpers zu vermeiden, besteht darin, den Antikörper an Protein A/G-Beads quer zu vernetzen oder ihn direkt kovalent an vorbehandelte Beads zu koppeln. Um Antikörper-Verunreinigungen bei dieser Vorgehensweise zu vermeiden, ist es jedoch entscheidend, das Antigen unter nicht-denaturierenden Bedingungen zu eluieren, da ansonsten die denaturierten Antikörperfragmente mit dem Antigen eluiert werden.

Erfolgt der Antigen-Nachweis auf dem Blot über einen unkonjugierten Primärantikörper und ein Sekundärantikörper-Konjugat, lassen sich Antikörper-Banden unter bestimmten Voraussetzungen durch die Wahl des Sekundärantikörpers umgehen:

Die zum Präzipitieren und Nachweisen verwendeten Primärantikörper:

1. stammen aus verschiedenen Wirtsspezies.

Hintergrundbanden des Präzipitations-Antikörpers auf dem Blot können durch Sekundärantikörper, die keine Kreuzreaktion (MinX) zur Spezies des Präzipitations-Antikörpers besitzen, ausgeschlossen werden.

Beispiel: Präzipitation mit polyklonalem Kaninchen anti-Zielprotein, Blot-Nachweis mit monoklonalem Maus anti-Zielprotein
> Sekundärantikörper Anti-Maus IgG (H+L) MinX Kaninchen etc. (z.B. Kat.-Nr. 115-035-146).

Anti-IgG/M (H+L) ohne Spezies-Kreuzreaktion (MinX) für den Western Blot

Viele weitere anti-Ig (H+L)-spezifische Antikörper für den Western Blot unterSekundärantikörper

2. stammen aus gleichen Wirtsspezies und

a. besitzen verschiedene Isotypen.
Durch die Auswahl eines Sekundärantikörpers, der spezifisch für die Sub/Klasse des Nachweis-Primärantikörpers ist, wird der Präzipitations-Antikörper auf dem Blot nicht erkannt.

Beispiel: Präzipitation mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein, Blot-Nachweis mit monoklonalem Maus (IgG2a) anti-Zielprotein
> Sekundärantikörper Anti-Maus IgG2a (z.B. Kat.-Nr. 115-035-206).

Anti-IgG-Subklassen- und Anti-IgM-spezifische Sekundärantikörper für den Western Blot

b. das Zielprotein liegt bei 50 kDa.
Sekundärantikörper gegen die leichten Ketten von Maus Ig/G reagieren im Blot nicht mit der reduzierten und denaturierten schweren Kette (50 kDa) des Präzipitations-Antikörpers. Sie binden nur an die reduzierte, denaturierte leichte Kette des präzipitierten Antikörpers (siehe Abbildung) sowie an die nativen leichten Ketten des Nachweis-Antikörpers. Eine Antikörperbande wird nur im Bereich der leichten Ketten, nicht aber im Bereich des Zielproteins detektiert.

Beispiel: Zielprotein ca. 50 kDa; Präzipitation mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein, Blot-Nachweis mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein
> Sekundärantikörper anti-Maus Ig/G leichte Kette (z.B. Kat.-Nr. 115-035-174).

c. das Zielprotein liegt bei 25 kDa.
Sekundärantikörper gegen das Fc-Fragment der schweren Ketten von Maus IgG reagieren nicht mit der reduzierten und denaturierten leichten Kette (25 kDa) von Antikörpern. Sie binden nur an die reduzierte, denaturierte schwere Kette des präzipitierten Antikörpers sowie an die schwere Kette des nativen Nachweis-Antikörpers. Eine Antikörperbande wird nur im Bereich der schweren Ketten, nicht aber im Bereich des Zielproteins markiert.
Anti-IgG Fc-spezifische Sekundärantikörper erkennen außerdem keine IgM o.a. Ig-Klassen.

Beispiel: Zielprotein ca. 25 kDa; Präzipitation mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein, Blot-Nachweis mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein
> Sekundärantikörper anti-Maus IgG Fc (z.B. Kat.-Nr. 115-035-071).

Anti-IgG Fc-spezifische Sekundärantikörper für den Western Blot

Anm.: Erkennt der Nachweis-Primärantikörper sein Zielprotein auch in nicht-reduzierter Form und ist das Zielprotein bezüglich seiner Größe u.a. in der SDS-PAGE darstellbar, kann die Probe ohne reduzierende Reagenzien aufgetragen werden. Der zum Präzipitieren verwendete Primärantikörper bildet dann nur eine Antikörperbande bei 150 kDa, welche den Nachweis von Zielproteinen außerhalb dieses Molekulargewichtsbereichs nicht stört.

Anti-Ig/G leichte Kette - spezifische Antikörper

Anti-Ig/G leichte Kette spezifische Antikörper reagieren mit nativen Primärantikörpern, die zur Detektion von Proteinen in Western Blots eingesetzt werden. Bei geeigneter Verdünnung reagieren sie im Blot nicht mit der reduzierten und denaturierten schweren Kette (50 kDa) des IgG-Moleküls. Hierdurch eignen sich die Antikörper hervorragend zur Detektion von Antigenen im Bereich von 50 kDa, wenn die Proben aus Immunpräzipitationsversuchen (IP) stammen, bei denen die denaturierte schwere IgG-Kette das Zielprotein überdecken kann.

Obwohl die anti-leichte Kette spezifischen Antikörper im Western Blot eine starke Reaktivität mit nativen leichten IgG-Ketten zeigt, kann es bei der Erkennung der reduzierten und denaturierten Form zu einer verringerten Sensitivität kommen. Wir empfehlen daher, die Antikörper nicht für eine sensitive / quantitative Detektion von leichten IgG-Ketten im Western Blot einzusetzen.

Um Kreuzreaktionen mit eventuell ebenfalls im Blot vorhandenen Immunglobulinen zu verhindern, wurden die Antikörper gegen Serumproteine aus vielen Spezies adsorbiert.



Zielproteine von 25 kDa können nach Immunpräzipitation am besten mit Anti-IgG-Fc-Fragment-spezifischen Antikörpern ohne Signalüberlagerungen in diesem Molekulargewichtsbereich nachgewiesen werden, da diese nicht mit der reduzierten und denaturierten leichten Kette von Antikörpern reagieren.

Abbildungen:

Fig. 1. Lanes 1, 2: detection of primary antibodies made in goat against a 50 kDa target protein; Lanes 3, 4: detection of heavy (50 kDa) and light (25 kDa) chains of reduced and SDS-denatured goat IgG separated by SDS-PAGE; Lanes 5, 6: reduced and SDS-denatured mouse IgG (control).

Fig. 2. Lanes 1-3: reduced and SDS-denatured mouse IgG (control); Lanes 4-8: detection of heavy (50 kDa) and light (25 kDa) chains of reduced and SDS-denatured goat IgG separated by SDS-PAGE.
Lanes 3, 4 (Fig. 1) and Lanes 4-8 (Fig. 2) demonstrate the relatively weak reactivity of the anti-goat light chain specific antibody with reduced and SDS-denatured light chains.

(By: Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)

Allgemeine Empfehlungen - Sekundärantikörper im WB

• kompatibel zu LI-COR® Odyssey
• quantitative Western Blots
• In-Gel Western Blots
• In-Cell- und On-Cell Western Arrays
• höchste Sensitivität und Spezifität

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790
Alexa Fluor® 680 ist ein im dunkelroten (far red) Spektrum emittierender Farbstoff (Amax: 684nm / Emax 702nm) und Alexa Fluor® 790 ein Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff (Amax: 783 nm / Emax 803 nm).
An Antikörper gekoppelte Dunkelrot- und Infrarotfarbstoffe sind aufgrund geringerer Quenching-Effekte, höherer Extinktionskoeffizienten der Farbstoffe und geringeren Autofluoreszenzhintergrundes sensitiver als herkömmliche Fluoreszenzfarbstoffe. Die deutlich stärkere Helligkeit erlaubt den Einsatz in einem breiten Spektrum fluoreszenzbasierter Methoden. Hierzu zählen hochsensitive Western Blots, quantitative Western Blots, In-Gel Western Blots, micro Western Arrays, In-Cell- und On-Cell Western Arrays, Gewebeschnitt-Imaging, Ganzkörper-Bildgebungsverfahren und andere Methoden, die eine hohe Leuchtkraft erfordern.

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790 für die Dunkelrot(far red)- und Infrarot-(infrared)-Detektion

 


Abb. 1: Doppelimmunfluoreszenz-Western Blot mit Alexa Fluor® 680 (far red) und Alexa Fluor® 790 (infrared) gekoppelten Sekundärantikörpern (Verdünnung 1:100.000). Maus (Spur 1)- und Ziegen-IgG (Spur 2) wurden mit ß-Mercaptoehanol reduziert, unter denaturierenden Bedingungen auf einem SDS-Gel aufgetrennt und danach auf einer Nitrozellulosemembran geblottet. Die schweren Ketten wurden anschließend mit Alexa Fluor® 790 gekoppeltem Ziege anti-Maus IgG, Fc-gamma Subklassen 1 spezifischem Antikörper (ohne Kreuzreaktion zu Serumproteinen aus Human, Bovin und Kaninchen) (grün, Kat. Nr. 115-655-205) und die leichten Ketten mit Alexa Fluor® 680 konjugiertem Ziege anti-Maus IgG leichte Kette- spezifischem Antikörpern adsorbiert gegen Serumproteine aus Bovin, Ziege, Pferd, Human, Kaninchen, Ratte und Schaf (rot) nachgewiesen (LiCor Odyssey Imager). Das Ziegen-IgG diente dabei als Hintergrundkontrolle. Beachten Sie, dass sich aufgrund der extremen Helligkeit der Farbstoffe sogar bei einer Verdünnung von 1:100.000 noch schwache Banden der schweren und leichten Kette des Ziegen-IgG abzeichnen (Abb. Jackson ImmunoResearch).

Eigenschaften von Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790

Jackson ImmunoResearch bietet eine große Auswahl an Alexa Fluor® 680- und Alexa Fluor® 790-konjugierten signalverstärkender anti-Biotin, anti-FITC & anti-HRPO Antikörper, affinitätsgereinigten Sekundärantikörpern, Streptavidin-Konjugaten und IgG-Kontrollen für Einzel- und Doppel-Western Blot-Färbungen. Die Sekundärantikörper sind gegen Immunglobuline aus anderen Spezies und Klassen adsorbiert, um eine kreuzreaktionsfreie Doppelmarkierung zu gewährleisten (Abb. 1).
Beide Farbstoffe können mit dem LiCor Odyssey System und allen oben aufgeführten hochsensitiven Methoden eingesetzt werden. Aufgrund der extrem hohen Empfindlichkeit empfehlen wir, die Antikörper in einer Verdünnung von 1:50.000 bis 1:200.000 einzusetzen. Links zu den neuen Produkten direkt in unserem Webshop finden Sie in der Tabelle.

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790-Konjugate

AntispeziesAlexa Fluor 680Alexa Fluor 790
anti-armenischer Hamster127-625-160127-655-160
anti-Huhn703-625-155703-655-155
anti-HumanZiege Anti-Human IgG, Fc (109-625-098)
Ziege Anti-Human IgM, µ-Kette (109-625-129)
Esel Anti-Human IgG (H+L) (709-625-149)
Ziege Anti-Human IgG, Fc (109-655-098)
Ziege Anti-Human IgM, µ-Kette (109-655-129)
Esel Anti-Human IgG (H+L) (709-655-149)
anti-KaninchenZiege Anti-Kaninchen IgG (H+L) (111-625-144)
Maus Anti-Kaninchen IgG, leichte Kette (211-622-171)
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) (711-625-152)
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) (111-655-144)
Maus Anti-Kaninchen IgG, leichte Kette (211-652-171)
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) (711-655-152)
anti-MausZiege Anti-Maus IgG, Fc (115-625-071)
Ziege Anti-Maus IgM, µ-Kette (115-625-075)
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) (115-625-146)
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) (115-625-166)
Ziege Anti-Maus IgG, leichte Kette (115-625-174)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 1 (115-625-205)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 2a (115-625-206)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 2b (115-625-207)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 3 (115-625-209)
Esel Anti-Maus IgG (H+L) (715-625-150)
Esel Anti-Maus IgG (H+L) (715-625-151)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc (115-655-071)
Ziege Anti-Maus IgM, µ-Kette (115-655-075)
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) (115-655-146)
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) (115-655-166)
Ziege Anti-Maus IgG, leichte Kette (115-655-174)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 1 (115-655-205)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 2a (115-655-206)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 2b (115-655-207)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 3 (115-655-209)
Esel Anti-Maus IgG (H+L) (715-655-150)
Esel Anti-Maus IgG (H+L) (715-655-151)
anti-Meerschwein 703-625-155 703-655-155
anti-RatteZiege Anti-Ratte IgG, Fc (112-625-071)
Ziege Anti-Ratte IgM, µ-Kette (112-625-075)
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) (112-625-143)
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) (112-625-167)
Ziege Anti-Ratte IgG, leichte Kette (112-625-175)
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) (712-625-150)
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) (712-625-153)
Ziege Anti-Ratte IgG, Fc (112-655-071)
Ziege Anti-Ratte IgM, µ-Kette (112-655-075)
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) (112-655-143)
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) (112-655-167)
Ziege Anti-Ratte IgG, leichte Kette (112-655-175)
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) (712-655-150)
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) (712-655-153)
anti-SchafMaus Anti-Schaf IgG, leichte Kette (213-622-177)
Esel Anti-Schaf IgG (H+L) (713-625-147)
Maus Anti-Schaf IgG, leichte Kette (213-652-177)
Esel Anti-Schaf IgG (H+L) (713-655-147)
anti-ZiegeMaus Anti-Ziege IgG, leichte Kette (205-622-177)
Esel Anti-Ziege IgG (H+L) (705-625-147)
Maus Anti-Ziege IgG, leichte Kette (205-625-177)
Esel Anti-Ziege IgG (H+L) (705-655-147)

 

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790-Streptavidin

KonjugatAlexa Fluor 680Alexa Fluor 790
Streptavidin016-620-084016-650-084

 

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790-Kontrollen

KonjugatAlexa Fluor 680Alexa Fluor 790
Esel IgG-Gesamtmolekül017-620-003017-650-003
Maus IgG-Gesamtmolekül015-620-003015-650-003
Ziege IgG-Gesamtmolekül005-620-003005-650-003

 

 

Abb. 2 : Normalisierte Darstellung der Anregungs- und Emissions-Spektra der neuen Alexa Fluor® 680- (links) und Alexa Fluor® 790 (rechts)-konjugierten Sekundärantikörper, gemessen mit einem M-Serien Spektrofluorometer von Photon Technology International, Inc. und einem Ultraspec 1100 pro von Amersham Biosciences (Abb. Jackson ImmunoResearch).