Mehrfachmarkierung mit MinX-Antikörpern

Die Auswahl von Sekundärantikörpern zur simultanen Detektion von mehr als einem Antigen hängt von wenigstens zwei wichtigen Kriterien ab:

A) Verfügbarkeit von Sekundärantikörpern, die
1. von derselben Wirtsspezies stammen, so dass sie einander nicht erkennen,
2. keine anderen Primärantikörper im Versuchssystem erkennen,
3. keine Immunglobuline anderer Spezies erkennen, die möglicherweise im Versuchssystem präsent sind, und
4. nicht mit dem untersuchten Gewebe oder Zellmaterial kreuzreagieren

B) Verwendung von Labeln (Fluorochrome, Enzym-Reaktionsprodukte, elektronendichte Partikel), die optisch gut aufgelöst werden können.

Die mit MinX (Minimal Cross-Reactivity/Reaction) gekennzeichneten, affinitätsgereinigten Antikörper werden speziell hergestellt, um diese Kriterien zu erfüllen. Sie wurden mittels ELISA als nicht kreuzreaktiv getestet und sind gegen IgG und/oder Serumproteine anderer Spezies adsorbiert.
Ihre Kreuzreaktivität (X) mit Immunglobulinen dieser angegebenen Spezies ist „minimal“ (Min), d. h. unterhalb 1%.
(Ha = Armenischer Hamster, Hs = Syrischer Hamster, Ck = Huhn, Hu = Human, Rb = Kaninchen, Ms = Maus, Gp = Meerschweinchen, Ho = Pferd, Rt = Ratte, Bo = Rind, Sh = Schaf, Sw = Schwein, Go = Ziege)

Das folgende Schema zeigt ein Beispiel für den Einsatz solcher Kreuzreaktions-minimierten Antikörper in einer Mehrfachmarkierung. Die in Schritt 3 verwendeten Sekundärantikörper erkennen sich gegenseitig nicht, da sie alle aus Esel stammen. Durch die Festphasen-Präadsorption gegen Serumproteine der Primärantikörper-Spezies erkennen sie auch nicht die anderen Primärantikörper aus Schritt 2. Ebenso reagieren sie nicht mit den möglicherweise im Rattengewebe vorhandenen Ratte-Immunglobulinen und Serumproteinen. Jedoch geht die durch Ig/ Serumprotein-Adsorptionen gewonnene Erhöhung der Spezifität auf Kosten der Sensitivität: Esel-Sekundärantikörper, die gegen Serumproteine von bis zu zehn verschiedenen Spezies adsorbiert wurden, sind weniger affin als Ziege-Sekundärantikörper, die gegen Ig/ Serumproteine von drei bis fünf verschiedenen Spezies adsorbiert worden sind.

Hinweis: Antikörper, die gegen eine nahe verwandte Spezies adsorbiert wurden, weisen z. T. eine reduzierte Epitoperkennung auf und können monoklonale Antikörper mit seltenen IgG-Subklassen (IgG2b, IgG3), die weitestgehend homolog mit der Spezies sind, gegen die präadsorbiert wurde, nur eingeschränkt erkennen.

Dreifachmarkierung von Rattengewebe

* Siehe auch: Beispiel Fab-Blocking von Gewebe

Hinweis: Der Nachweis von Antigen A, B und C kann parallel oder sukzessiv erfolgen. Im Parallelansatz werden die Antikörper in Schritt 2 (b, d, f) und 3 (c, e, g) in einem Cocktail aufgetragen, im Sukzessivansatz wird von a) bis g) jeweils in Einzelschritten nacheinander inkubiert. In beiden Vorgehensweisen wird zwischen den Antikörper-Inkubationen und nach der Blockierung (a) jeweils gründlich gewaschen. Bei starkem Hintergrund kann im Sukzessivansatz eine wiederholte Blockierung vor Schritt d) und f) erforderlich sein. Die Mehrfachmarkierung kann im Parallelverfahren durchgeführt werden, wenn das Färbe- und Hintergrundverhalten der Antikörper sich durch Mischung im Vergleich zu Einzelmarkierungen (Sukzessivfärbungen) nicht verändert. In Mischung können Antikörper (Immunglobuline) aufgrund spezifischer oder unspezifischer Wechselwirkungen miteinander reagieren und den Antigennachweis erschweren. Aus diesem Grund sollte dem Antikörperverdünnungspuffer außerdem kein Normalserum zugesetzt werden.

> Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen

> Beispielprotokoll: Vierfach-Immunfluoreszenzmarkierung im Parallelansatz

Eine gute Übersicht über das Mehrfarben-Immunfluoreszenz-Labeling in der konfokalen Mikroskopie gibt der Beitrag von Brelje, Wessendorf und Sorenson, “Multi-color laser scanning confocal immunofluorescence microscopy: Practical application and limitations.” In Cell Biological Applications of Confocal Microscopy, B. Matsumoto. Orlando, FL: Academic Press, Inc. (Methods Cell. Biol. 1993, Vol. 38, 97; Methods Cell. Biol. 2002, Vol. 70, 165).