Beispielprotokoll: Blockieren von endogenen Immunglobulinen mit Fab-Fragmenten auf Mausgewebe

Probenmaterial vorbereiten: Paraffinschnitte hydrieren und Antigendemaskierung nach Herstellerangaben für den Primärantikörper durchführen, Gefrierschnitte fixieren und in Puffer waschen, Zellen in Puffer waschen, fixieren und nochmals waschen.

Waschen: 2 x 5 Minuten mit TBS.

  1. Optional: Gewebeschnitte durch Inkubation mit 1% TX-100 in TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorreinigen.
  2. Beseitigung endogener Peroxidaseaktivität in 0,6% H2O2 in TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
    Hinweis: alternativ gebrauchsfertige Peroxidase-Blockierungslösung von dianova verwenden (ACA500(IVD)ACA999(IVD)).
  3. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  4. Blockierung mit Normalserum: Inkubation der Zellen / Schnitte mit 5% Normalserum in TBS (+ 0,3% TX-100) für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindungsstellen für nachfolgend eingesetzten Antikörper zu blockieren.
    Hinweis: Normalserum aus derselben Spezies wie die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers (z. B. Ziegenserum, Kat.-Nr. 005-000-121).
  5. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  6. Blockierung endogener Maus-Immunglobuline: Zellen / Schnitte mit 20µg – 100 µg/ml unkonjugierten Fab-Fragmenten anti-Maus IgG (H+L) in TBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: 1. Fab-Fragmente aus derselben Spezies wie die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers (z. B. Fab Ziege anti-Maus IgG (H+L), Kat.-Nr. 115-007-003). 2. Die Blockierungseffizienz kann über die Konzentration der Fab-Fragmente und über die Inkubationszeit (2 Stunden bei Raumtemperatur oder Übernachtinkubation bei 4°C) erhöht werden.
  7. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  8. Primärantikörper-Inkubation: Zellen / Schnitte mit nach Herstellerangaben verdünntem Maus-Primärantikörper für 30 – 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Verdünnung in TBS/1%BSA oder in Normalserum-Blockierungslösung (5.).
  9. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  10. Sekundärantikörper-Inkubation: Zellen / Gewebeschnitte mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper in TBS entsprechend Verdünnungsempfehlung des Herstellers (ca. 0,2 – 2 µg/ml) für 30 – 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (z. B. Ziege anti-Maus IgG (H+L), Kat.-Nr. 115-035-062115-035-146115-035-166).
  11. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  12. Substrat-Inkubation: für 3 – 7 Minuten in der Substratlösung (z. B. DAB) bei Raumtemperatur inkubieren (Kat.-Nr. ACH500 (IVD)ACT500(High Contrast, IVD).
  13. In Leitungswasser spülen.
  14. Mit Hämatoxylin gegenfärben, falls erwünscht (Kat.-Nr. HAQ500).
  15. In destilliertem Wasser 3 x 5 Minuten spülen.
  16. Lufttrocknen lassen und mit permanentem Eindeckmedium eindecken (Kat.-Nr. PMT030).

Hinweise:

  1. Statt TBS als Puffer für Blockierungs-, Wasch- und Antikörperverdünnungslösung kann auch PBS eingesetzt werden. TBS kann für einen geringeren Hintergrund vorteilhafter sein als PBS.
  2. Eine Hintergrundfärbung von Probenmaterial kann nicht nur eine Ursache haben. So können u. a. auch endogene Peroxidase-Aktivität im Probengewebe oder Fc-Rezeptoren einen Einfluss haben. Peroxidase-Aktivität wird durch einen Blockierungsschritt vor der Blockierung mit Normalserum oder nach der Primärantikörperinkubation inhibiert. Die Bindung des Sekundärantikörpers an Fc-Rezeptoren von Zellen und Geweben lässt sich einerseits durch eine geeignete Blockierung mit Normalserum oder speziellen Fc-Rezeptor-Blockierungslösungen verhindern, andererseits durch die Verwendung von F(ab’)2-Fragment-Sekundärantikörpern (z. B. in Schritt 11. F(ab’)2 Ziege anti-Maus IgG(H+L), Kat.-Nr. 115-036-062).

anti-Hapten Konjugate für FISH

Erfolgreiche Blockierung heterophiler Antikörper (HAMA)

Ungewollte Kreuzreaktivitäten führen immer wieder zu falschen Ergebnissen in diagnostischen Immunoassays. Insbesondere heterophile Antikörper (Antikörper, die mit weiteren Antigene als dem spezifischen Antigen kreuzreagieren), wie Rheumafaktoren oder Human-Anti-Maus-Antikörper (HAMA), können eine Ursache sein.

HAMA Blocker ImmunoRegeants
ImmunoReagents Bulk Immunglobuline

Hochreine Immunglobuline (IgGs) von ImmunoReagents ermöglichen eine zuverlässige Blockierung heterophiler Antikörper. Störeffekte bei der Analyse humaner Proben werden hiermit vermieden und reproduzierbare Ergebnisse erzielt. Mit weniger Falsch-positiven oder Falsch-negativen Ergebnissen wird die Qualität und Wettbewerbsfähigkeit von Diagnosekits erheblich verbessert.

Gereinigte Immunglobuline (Protein A oder Protein G) für die Blockierung heterophiler Antikörper sind in verschiedenen Verpackungsgrößen (mg – g) erhältlich. Konzentration: 8-12 mg/ml.

Jedes Produkt wird strengen Qualitätskontrollen unterzogen, um eine überdurchschnittliche Performance zu gewährleisten.

Bulk IgG HPLC Analyse ImmunoReagents

Repräsentatives HPLC-Profil für ImmunoReagents’ IgGs: Die effektiven HAMA Blocker zeichnen sich durch eine hohe Qualität und Reinheit (95% basierend auf SDS-Page) aus.

Wir bieten Ihnen kostengünstige und verlässliche HAMA Blocker in unterschiedlichen Verpackungsmengen (auch Bulk):

wdt_IDKat.-Nr.ProduktbeschreibungMengePreis* [EUR]
1Dk-003-ZEsel IgG, Protein G-gereinigt10mg115.00
2Gt-003-ZZiege IgG, Protein G-gereinigt10mg123.00
3Ha-003-Z.1Hamster IgG, Protein G-gereinigt1gPreis auf Anfrage
4Ha-003-Z.01Hamster IgG, Protein G-gereinigt100mg318.00
5Ha-003-Z.05Hamster IgG, Protein G-gereinigt500mg559.00
6Hu-003-C.1Human IgG, Protein A-gereinigt1gPreis auf Anfrage
7Hu-003-C.01Human IgG, Protein A-gereinigt100mg318.00
8Hu-003-C.05Human IgG, Protein A-gereinigt500mg559.00
9Hu-003-CHuman IgG, Protein A-gereinigt10mg156.00
10Mu-003-C.1Maus IgG, Protein A-gereinigt1gPreis auf Anfrage

Bulk-Mengen erhältlich. Bitte nehmen Sie Kontakt mit uns auf.

Abbildungen mit freundlicher Genehmigung von ImmunoReagents Inc.

*Preise Stand Juni 2019, Preisänderungen vorbehalten

Western Blot Troubleshooting Guide

Der Western Blot gehört zu den Routinetechniken in der heutigen Zell- und Molekularbiologie. Trotzdem kommt es bei der Auswertung der Daten immer wieder zu Schwierigkeiten, da die Ergebnisse nicht eindeutig sind. Die Ursachen können verschiedenster Natur sein. In diesem Ratgeber haben wir für Sie die häufigsten Probleme und deren Lösungsansätze zusammengestellt.

Häufig werden die falschen Antikörper verwendet. In unseren Webshop finden Sie die richtigen Primärantikörper und Sekundärantikörper, wählen Sie hierfür in der Rubrik Anwendung das Stichwort „Western Blot“ aus. Bei weiteren Fragen helfen Ihnen unsere Experten gerne weiter.

Werden Sie mit unserem Troubleshooting Guide zum Western Blot-Experten:

Kein Signal/ Geringe Sensitivität

Problem

Analyt wird nicht detektiert.

Lösung / Ursachen

  • Überprüfen Sie die eingesetzte Proteinmenge: Bradford-Test; BCA-Methode
  • Erhöhen Sie die Proteinkonzentration
  • Verwenden Sie, wenn möglich, eine Positivkontrolle, in der das Antigen hoch exprimiert ist.
  • Verwenden Sie einen frischen LysepufferGeben Sie einen Protease-Inhibitor zum Probenpuffer
  • Lagern Sie Ihre Proben auf Eis (4°C)

Analyt läuft während der Elektrophorese aus dem Gel.

  • Stellen Sie anhand des Größenmarker sicher, dass das gewünschte Protein (kDa) noch im Gel vorhanden ist.
  • Reduzieren Sie die Dauer der Gelelektrophorese

Kein Transfer vom Trenngel auf Membran

  • Überprüfen Sie, ob ein Transfer vom Gel auf die Membran erfolgt ist: Ponceau S Staining
  • Stellen Sie anhand einer Ladekontrolle (Housekeeping) sicher, dass der Transfer gleichmäßig erfolgt ist.

Falsche Transfermembran verwendet

PVDF

  • Eine PVDF Membran muss vor Gebrauch mit Methanol aktiviert werden.
  • Höhere Bindeeigenschaften (170 bis 200 μg/cm2)
  • Kann zu mehr Hintergrund führen als bei einer Nitrocellulose Membran
  • Ist geeignet für das Verwenden von Stripping-Puffern und anschließender Inkubation mit neuen Antikörpern („reprobing“)

Nitrocelluse

  • Geringe Bindeeigenschaften (80 bis 100 μg/cm2)
  • Weniger Hintergrund

Wählen Sie die richtige Porengröße für Ihr Analyt:

  • 0.1, 0.2 oder 0.45μm. (0,45μm eignet sich für die meisten Anwendungen (≥ 20kDa))

Transferbedingungen

  • Während des Transfers muss ein luftblasenfreier Kontakt zwischen Membran und Gel bestehen.
  • Verringern Sie die Transferzeit oder Spannung („Over transfer“).

Dauer der Blockierung

Reduzieren Sie die Inkubationszeit

  • 1h bei Raumtemperatur

Wahl des Blockierungsreagenz

Antigen Maskierung

  • Verwenden Sie eine niedrigere Konzentration
  • Verwenden Sie einen anderen Puffer

Wir empfehlen für das Blockieren 5% Normalserum aus der Spezies zu verwenden, aus der der Sekundärantikörper stammt. Alternativ IgG-freies BSA.

Zu starkes waschen

  • Verringern Sie die Zeit und Anzahl der Waschschritte
  • 3x 5 Min (RT)
  • Verringern Sie die Konzentration an Detergenz
  • 0.1-0.5% Tween 20

Falscher Primärantikörper

Stellen Sie sicher, dass der Primärantikörper für Western Blot geeignet ist (Datenblatt)

Inkubationszeit (Primärantikörper)

Verlängern Sie die Inkubationszeit

  • Über Nacht bei 4°C

Antikörperkonzentration zu niedrig

  • Überprüfen Sie die verwendete Antikörperkonzentration.
  • Überprüfen Sie die Affinität
  • Setzen Sie zunächst eine höhere Konzentration ein als im Datenblatt angegeben. Anschließend wird die Konzentration schrittweise verringert.

Falscher Sekundärantikörper

Prüfen Sie, ob der eingesetzte Sekundärantikörper den verwendeten Primärantikörper binden kann (Datenblatt)

Sekundärantikörper-Konjugat (HRP) beeinträchtigt

  • Verwenden Sie kein Sodium Azide im Puffer. Dieses inhibiert die Reaktion des HRP (Horseradish peroxidase)-Konjugates.
  • Verwenden Sie kein Glycerol mit einem ACS grad von unter 99,5%. Dieses inhibiert die Reaktion des HRP (Horseradish peroxidase)-Konjugates.
  • Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen oder Einfrieren Ihrer Sekundärantikörper.
  • Antikörperlösungen sollten aliquotiert werden

Tipps zur Lagerung von Antikörpern

ECL Reagenz abgelaufen

Verwenden Sie eine neue ECL Reagenz

ECL Reagenz kontaminiert

Verwenden Sie eine neue ECL Reagenz

Belichtungszeit

  • Abhängig von dem Antigenexpressionslevel, kann die notwendige Belichtungszeit variieren.
  • Erhöhen Sie in kleinen Schritten die Belichtungszeit

Starker Hintergrund

Problem

Lösung / Ursachen

Hohe Antigen-Expression

Verringern Sie die Proteinkonzentration

Wahl des Blockierungsreagenz

  • Milchpulver ist nicht geeignet, wenn phosphorylierte Proteine detektiert werden sollen.
  • Der Primärantikörper kann mit dem enthaltenen Casein kreuzreagieren.
  • Milchpulver ist nicht geeignet, wenn Strepavidin/Avidin Konjugate verwendet werden.
  • Milch enthält endogenes BiotinBSA und Milchpulver sind nicht geeignet, wenn Anti-Ziege/ Rind oder Schaf Sekundärantikörper verwendet werden.
  • BSA und Milch können Immunglobuline aus dem Rind enthalten, womit die o.g. Sekundärantikörper kreuzreagieren.

Wir empfehlen für das Blockieren 5% Normalserum aus der Spezies zu verwenden, aus der der Sekundärantikörper stammt. Alternativ IgG-freies BSA.

Inkubationszeit (Blockierungsreagenz)

Erhöhen Sie die Inkubationszeit

  • 1h bei Raumtemperatur

Falsche Konzentration des Primärantikörper

  • Verringern Sie die Konzentration des Primärantikörpers
  • Verdünnungsreihe

Falsche Konzentration des Sekundärantikörper

  • Verringern Sie die Konzentration des Sekundärantikörpers
  • Verdünnungsreihe

Belichtungszeit

Reduzieren Sie schrittweise die Belichtungszeit.

Transfermembran

  • Verwenden Sie Pinzetten für die Membran
  • Lassen Sie die Membran nicht austrockenen

Detektionsreagenz

Reduzieren Sie die Substratkonzentration

Unspezifische Banden oder Punkte auf dem Blot

Problem

Lösung / Ursachen

Protein ist degradiert

  • Verwenden Sie ein frisches Lysat
  • Lagern Sie Ihre Proben auf Eis (4°C)
  • Geben Sie einen Protease Inhibitor zum Probenpuffer

Zustand der Probe

  • Andere Isoform wird detektiert
  • Posttranslationale Modifikation
  • Einfluss auf Molekulargewicht, mögliche Entstehung von Doppelbanden
  • Verwenden Sie, wenn möglich, eine negative Kontrolle
  • Verwenden Sie, wenn möglich, eine positiv Kontrolle
  • Bakterielle Kontamination der Probe/ im Puffer
  • Verwenden Sie deionisiertes Wasser

Transfermembran

  • Entfernen Sie vor dem Transfer alle Luftblasen zwischen Gel und Membran.
  • Waschen Sie die Membran kurz nach dem Transfer, vor dem Blocken, um mögliche Reste von Gel und/oder SDS-Partikel zu entfernen.

Primärantikörper

  • Prüfen Sie, ob der Primärantikörper spezifisch bindet.
  • Verwenden Sie in einer Kontrolle nur den Sekundärantikörper, ohne Primärantikörper.
  • Optimieren Sie die Antikörperkonzentration

Exosomen: Nachweis und Quantifizierung

Als Vesikel zum Transport molekularer Informationen (mRNA, miRNA, Proteine, Lipide) von Sender- zu Empfängerzelle stehen Exosomen im Fokus der Forschung. Insbesondere der molekulare Mix von RNA und Proteinen als Botschaft über den aktuellen Zustand der Genexpression stehen im Vordergrund des Interesses bei der Untersuchung der interzellulären Kommunikation, der Exosomen-Funktion oder der Entwicklung neuer Diagnostika. Mit den magnetischen Nachweis- und Quantifizierungskits von ImmunoStep können Exosomen effizient gemessen und durchflusszytometrisch quantifiziert werden. Die magnetischen Immunobead-Kits von ImmunoStep sind einfach in der Handhabung und erlauben eine zuverlässige Analyse von Exosomen aus menschlichen Körperflüssigkeiten und Zellkulturproben in der Durchflusszytometrie.

Whitepaper-Download Exosomen-Analyse

Klassifizierung diffuser Gliome

Der praktische Ansatz für die Diagnose von Astrozytomen und Oligodendrogliomen beginnt im Routinelabor mit der immunhistochemischen Untersuchung der ATRX und IDH1 R132H Expression. Die schrittweise Analyse molekularer Parameter mit einer IHC für ATRX und IDH1 R132H zu Beginn, gefolgt von einer 1p/19q Analyse mit anschliessender IDH-Sequenzierung führt abschliessend zu einem deutlich geringeren molekularen Testaufwand für die eindeutige Diagnose (Reus et al., 2015).

Charakteristische Merkmale der 3 wichtigsten molekularen Gruppen adulter Gliome:

Diffuses Gliom mit IDH Mutation
und 1p/19q-Codeletion
Diffuses Gliom mit
IDH Mutation
Diffuses Glioma ohne
IDH Mutation
Biomarker
IDH1/2
1p/19q
ATRX
hTERT-Promotor
mutiert
Co-deletiert
nukleäre Expression
mutiert
mutiert
intakt
Verlust nukleäre Expression
Wildtyp
Wildtyp
intakt
nukleäre  Expression
mutiert
Typische histologische Erscheinung und Prognose
Histologie
WHO Grading
mediane Überlebenszeit
oligodendroglial
II oder III
>15 Jahre
astrozytisch
II oder III (IV)
8-12 Jahre
astrozytisch
IV (II oder III)
<2-3 Jahre

Die IHC-Kombination von ATRX und IDH1 R132H reduziert den molekularen Testaufwand.

Immunohistochemical staining (IHC) with anti-IDH1 R132H Antibody (clone H09) - dianova

Anti-IDH1 R132H
Klon H09
#DIA-H09
0.5ml
1:20-1:50

IDH1 R132H
Die 2016 CNS WHO Zertifikation empfiehlt IDH1 R132H IHC als Rückrat für die Differentialdiagnose von Gliomen. Eine positive IDH1 R132H IHC ist dabei ein günstiger prognostischer Marker.


Immunohistochemical staining (IHC) with anti-ATRX Antibody (clone AX1) - dianova

Anti-ATRX
Klon AX1
#DIA-AX1
0.5ml
1:100-1:200

ATRX
ATRX Mutationen in Gliomen führen zu einem Verlust der nukleären Expression von ATRX (rechts), was mithilfe einer IHC-Analyse dargestellt werden kann. Ein Verlust der nukleären ATRX Expression und eine gleichzeitige 1p/19q Codeletion können in fast allen Fällen ausgeschlossen werden.


P53 und Ki67 sind hilfreiche Zusatzmarker für die Einordnung diffuser Gliome.

Immunohistochemical staining (IHC) with anti-p53 Antibody (clone CC53) - dianova

Anti-p53
Klon CC53
#DIA-530
0.5ml
1:100-1:200

p53

p53 kann als zusätzlicher Marker eingesetzt werden, da es Hinweise darauf gibt, dass es einen Zusammenhang zwischen der p53 Expression und der Deletion 1p/19q gibt, so dass eine Analyse auf genetischer Ebene nachrangig wäre.


Immunohistochemical staining (IHC) with anti-Ki-67/MIB1 Antibody (clone Ki-67P) - dianova

Anti-Ki67
Klon Ki67P
#DIA-670
0.5ml
1:100-1:200

Ki-67
Hohe Ki-67 Expression ist dominant in IDH wildtyp Gliomen und eine geringe Ki-67 Expression wird mit IDH1 Mutationen in primären Gliomen assoziiert. Der mitotische Index ist signifikant mit dem Ausgang von IDH Wildtyp Tumoren korreliert.


Literatur:

Reuss DE et al. ATRX and IDH1-R132H immunohistochemistry with subsequent copy number analysis and IDH sequencing as a basis for an “integrated” diagnostic approach for adult astrocytoma, oligodendroglioma and glioblastoma. Acta Neuropathol. 129(1):133-146, 2015

Anti-Maus FACS-Antikörper

Maus-Immunologie: Antikörper für die Durchflusszytometrie

CopyPDFShow entriesSearch:

KatalognummerProduktWirtKlonKonjugatMengePreis *
MO115A (V100)Anti-CD115RatteCSF-1RAPC100 µg344 EUR
MO115A (V25)Anti-CD115RatteCSF-1RAPC25 µg143 EUR
MO115B (V100)Anti-CD115RatteCSF-1RBiotin100 µg120 EUR
MO115B (V25)Anti-CD115RatteCSF-1RBiotin25 µg97 EUR
MO115CFB (V100)Anti-CD115RatteCSF-1RCF-Blue100 µg264 EUR
MO115CFB (V25)Anti-CD115RatteCSF-1RCF-Blue25 µg143 EUR
MO115F (V100)Anti-CD115RatteCSF-1RFITC100 µg165 EUR
MO115F (V25)Anti-CD115RatteCSF-1RFITC25 µg119 EUR
MO115F (V500)Anti-CD115RatteCSF-1RFITC500 µg406 EUR
MO115PE (V100)Anti-CD115RatteCSF-1RRPE100 µg208 EUR
MO115PE (V25)Anti-CD115RatteCSF-1RRPE25 µg109 EUR
MO115PP (V100)Anti-CD115RatteCSF-1RPerCP100 µg333 EUR
MO115PP (V25)Anti-CD115RatteCSF-1RPerCP25 µg154 EUR
MO115PP5.5 (V100)Anti-CD115RatteCSF-1RPerCP-Cy5.5100 µg355 EUR
MO115PP5.5 (V25)Anti-CD115RatteCSF-1RPerCP-Cy5.525 µg160 EUR
MO115PU (V100)Anti-CD115RatteCSF-1Runkonj.100 µg219 EUR
MO115PU (V500)Anti-CD115RatteCSF-1Runkonj.500 µg421 EUR
MO117A (V100)Anti-CD117Ratte2B8APC100 µg260 EUR
MO117A (V25)Anti-CD117Ratte2B8APC25 µg131 EUR
MO117B (V50)Anti-CD117Ratte2B8Biotin50 µg123 EUR
MO117B (V500)Anti-CD117Ratte2B8Biotin500 µg325 EUR
MO117F (V50)Anti-CD117Ratte2B8FITC50 µg208 EUR
MO117F (V500)Anti-CD117Ratte2B8FITC500 µg305 EUR
MO117PE (V200)Anti-CD117Ratte2B8RPE200 µg305 EUR
MO117PE (V50)Anti-CD117Ratte2B8RPE50 µg143 EUR
MO117PP (V100)Anti-CD117Ratte2B8PerCP100 µg344 EUR
MO117PP (V25)Anti-CD117Ratte2B8PerCP25 µg154 EUR
MO117PP5.5 (V100)Anti-CD117Ratte2B8PerCP-Cy5.5100 µg380 EUR
MO117PP5.5 (V25)Anti-CD117Ratte2B8PerCP-Cy5.525 µg168 EUR
MO117PU (V50)Anti-CD117Ratte2B8unkonj.50 µg118 EUR
MO117PU (V500)Anti-CD117Ratte2B8unkonj.500 µg281 EUR
MO11BA (V100)Anti-CD11bRatteM1/70APC100 µg264 EUR
MO11BA (V25)Anti-CD11bRatteM1/70APC25 µg141 EUR
MO11BB (V100)Anti-CD11bRatteM1/70Biotin100 µg202 EUR
MO11BB (V25)Anti-CD11bRatteM1/70Biotin25 µg120 EUR
MO11BCFB (V100)Anti-CD11bRatteM1/70CF-Blue100 µg242 EUR
MO11BCFB (V25)Anti-CD11bRatteM1/70CF-Blue25 µg131 EUR
MO11BF (V100)Anti-CD11bRatteM1/70FITC100 µg165 EUR
MO11BF (V25)Anti-CD11bRatteM1/70FITC25 µg119 EUR
MO11BF (V500)Anti-CD11bRatteM1/70FITC500 µg267 EUR
MO11BPE (V100)Anti-CD11bRatteM1/70RPE100 µg219 EUR
MO11BPE (V25)Anti-CD11bRatteM1/70RPE25 µg148 EUR
MO11BPP (V100)Anti-CD11bRatteM1/70PerCP100 µg333 EUR
MO11BPP (V25)Anti-CD11bRatteM1/70PerCP25 µg157 EUR
MO11BPP5.5 (V100)Anti-CD11bRatteM1/70PerCP-Cy5.5100 µg294 EUR
MO11BPP5.5 (V25)Anti-CD11bRatteM1/70PerCP-Cy5.525 µg140 EUR
MO11BPU (V100)Anti-CD11bRatteM1/70unkonj.100 µg154 EUR
MO11BPU (V500)Anti-CD11bRatteM1/70unkonj.500 µg264 EUR
MO11CA (V100)Anti-CD11cHamster armenischN418APC100 µg160 EUR
MO11CA (V25)Anti-CD11cHamster armenischN418APC25 µg75 EUR

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*Preise zzgl. MwSt., inkl. Versand

Fix & Perm

AN DER GRUB ist jetzt Nordic-MUbio! Alle Produkte von AN DER GRUB finden Sie weiterhin bei dianova, ab sofort aber unter dem Label der Firma Nordic-MUbio. Hierzu zählen auch die ADG-Produkte FIX & PERM® und ADG-Lyse. Die intrazelluläre Färbung von Biomarkern mit Hilfe von Antikörpern in der Durchflusszytometrie ermöglicht sowohl in der Forschung als auch in der Diagnostik eine Vielzahl von phänotypischen und funktionellen Analysen.

Eine sichere phänotypische Identifizierung bestimmter Zelltypen erfordert manchmal die Markierung sowohl intra- als auch extrazellulärer Proteine. Zusätzlich kann die zytoplasmatische Lokalisation von Membranproteinen ein hochgradig verlässlicher Marker für die Abstammung von Krebszellen sein. Dies gilt zum Beispiel für die zytoplasmatische Lokalisation von CD3 und CD22 bei schwer differenzierbarer akuter Leukämie.

In den oben genannten Fällen und für viele andere zellbiologische und funktionelle Fragestellungen ist eine intrazelluläre Färbung von Antigenen eine absolute Notwendigkeit. Das FIX & PERM®-Kit von Nordic-MUbio ist der Goldstandard für die gleichzeitige Fixierung und Permeabilisierung von Zellen für die Durchflusszytometrie und bietet diverse Vorteile gegenüber anderen Methoden der Permeabilisierung.

FIX & PERM® Kits und Reagenzien

BestellnummerNameInhalt
GAS-002FIX & PERM Kit (CE-IVD)200 Tests
GAS-002-1FIX & PERM Kit (CE-IVD)1000 Tests
GAS-002A-1FIX & PERM Reagenz A (Fixierungsmedium) (CE-IVD)1000 Tests
GAS-002B-1FIX & PERM Reagenz B (Permeabilisierungsmedium) (CE-IVD)1000 Tests
GAS-002FOCFIX & PERM Kit (CE-IVD)kostenfreies Muster (15 Tests)
GAS-002MFIX & PERM Kit (CE-IVD)50 Tests

Vorteile von FIX & PERM®

  • Milde Fixierung der Zellen und sehr guter Erhalt der Scattereigenschaften
  • Ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis von intra- und extrazellulären Markern
  • Schnelle Durchführung der Färbung in weniger als einer Stunde
  • Zellen sind bis zu 24 h stabil oder können sofort gemessen werden
  • Strenge Qualitätskontrollen garantieren höchste Lot-zu-Lot-Konsistenz der Reagenzien und dadurch gleichbleibende Scattereigenschaften der untersuchten Leukozyten – auch über mehrere Versuche
  • für die Verwendung mit FIX & PERM® optimierte Antikörper zur sicheren Diagnostik akuter Leukämien

FIX & PERM® besteht aus 2 Komponenten, die nacheinander angewendet werden. Lösung A ermöglicht eine milde Fixierung der Zellen und Lösung B permeabilisiert die Zellen. Die spezielle Zusammensetzung der Reagenzien verringert den Hintergrund und erlaubt den gleichzeitigen Einsatz von Permeabilisierungspuffer und fluoreszenzgekoppeltem Antikörper. Dies ermöglicht die Färbung von intrazellulären Strukturen und intranukleären Antigenen. Hierzu zählen unter anderem nukleäre Enzyme, Onkoproteine, Cytokine und Immunglobuline.

Färbeprotokoll

Probenmaterial: 50 µl Gesamtblut, Knochenmark oder mononukleäre Zellsuspension in 5 ml Probengefäß:

  • 100 µl Reagenz A hinzufügen (Fixierungsmedium – Lagerung und Gebrauch bei RT)
  • 15 Minuten bei RT inkubieren
  • Mit 5 ml PBS waschen und anschließend bei 300 g für 5 Minuten zentrifugieren
  • Überstand abnehmen; 100 µl Reagenz B (Permeabilisierungsmedium)  und 20 µl des Antikörperkonjugats zum Pellet hinzufügen
  • Bei geringer Geschwindigkeit für 1-2 Sekunden vortexen
  • 15 Minuten bei RT inkubieren
  • Mit 5 ml PBS waschen und anschließend bei 300 g für 5 Minuten zentrifugieren
  • Überstand abnehmen und zur direkten Analyse Zellen in FACS-Puffer aufnehmen, für spätere Analyse Zellen in 0,5 ml 1%-iger Formaldehyd-Lösung resuspendieren und bis zur Messung bei 2-8°C im Dunkeln lagern
  • Die Analyse sollte innerhalb von 24 Stunden erfolgen

Die Mehrzahl aller monoklonalen Antikörperkonjugate kann mit dem Standardprotokoll von FIX & PERM® genutzt werden. In einigen Fällen kann es notwendig sein, die Inkubationszeit des Fixierungsschrittes zu optimieren.

Insbesondere in der Diagnostik akuter Leukämien, in Fällen wo B-Zell-, T-Zell- oder myeloische Oberflächenantigene fehlen oder der Immunphänotyp unklar oder biphänotypisch ist, erweist sich die zusätzliche Markierung cytoplasmatischer Antigene zur sicheren Bestimmung der Linienzugehörigkeit als sehr wichtig. Nordic-MUbio bietet eigens dafür entwickelte und für den Einsatz mit FIX & PERM® optimierte Marker für die Leukämiediagnostik an:

Zur Verwendung mit FIX & PERM® optimierte FITC- und PE-Konjugate für die Leukämiediagnostik für gleichzeitige intra- und extrazelluläre Markierung

BestellnummerAntigenIsotypKlonFormatMenge
GM-4011CD3IgG1UCHT1gereinigt0,2 mg
GM-4012CD3IgG1UCHT1FITC-labeled100 Tests
GM-4013CD3IgG1UCHT1PE-labeled100 Tests
GM-4051CD22IgG1RFB4gereinigt0,2 mg
GM-4052CD22IgG1RFB4FITC-labeled100 Tests
GM-4053CD22IgG1RFB4PE-labeled100 Tests
GM-4111LactoferrinIgG14C5gereinigt0,2 mg
GM-4113LactoferrinIgG14C5PE-labeled100 Tests
GM-4131LysozymeIgG1LZ-2gereinigt0,2 mg
GM-4132LysozymeIgG1LZ-2FITC-labeled100 Tests
GM-4152CD68IgG1Ki-M7FITC-labeled100 Tests
GM-4191Myeloperoxidase(MPO-C2)IgG18E6gereinigt0,2 mg
GM-4192Myeloperoxidase(MPO-C2)IgG18E6FITC-labeled100 Tests
GM-4193Myeloperoxidase(MPO-C2)IgG18E6PE-labeled100 Tests

Für FIX & PERM® optimierte Kombireagenzien für die Leukämiediagnostik

BestellnummerAntigenKlonIsotypFormatMenge
GIC-201NegativkontrolleVl-AP / Vl-APIgG1 / IgG1FITC-labeled / PE-labeled50 Tests
GIC-206Lysozyme / LactoferrinLZ-2 / 4C5IgG1 / IgG1FITC-labeled / PE-labeled50 Tests
GIC-212Myeloperoxidase / Lactoferrin8E6 / 4C5IgG1 / IgG1FITC-labeled / PE-labeled50 Tests
GIC-213Myeloperoxidase / CD38E6 / UCHT1IgG1 / IgG1FITC-labeled / PE-labeled50 Tests
GIC-214Myeloperoxidase / CD228E6 / RFB4IgG1 / IgG1FITC-labeled / PE-labeled50 Tests

Allgemeine Empfehlungen zur Verwendung von Sekundärantikörpern im Western Blot

1. Kontrollen

Um spezifische von unspezifischen Banden des Probenmaterials abzugrenzen, grundsätzlich bei jedem Blot eine Kontrolle mitlaufen lassen, in der nur Sekundärantikörper-Konjugat ohne Primärantikörper aufgetragen wurde.

2. Sekundärantikörper-Verdünnung

Der Sekundärantikörper sollte nicht zu hoch konzentriert eingesetzt werden, da dies die Entstehung unspezifischer Hintergrundbindung begünstigt. In den meisten Anwendungen kann der Sekundärantikörper weit über 1:10.000 verdünnt werden, bei ECL sogar doppelt so hoch wie bei Verwendung von Farbsubstraten. Die optimale Verdünnung variiert außerdem zwischen verschiedenen Chargen.

Empfohlene Verdünnungen für Western Blot:

HRPO-Konjugate: 1:5.000 – 1:100.000 (keine ECL) / 1:10.000 – 1:200.000 (ECL)
Alk. Phos.-Konjugate: 1:5.000 – 1:50.000
Biotin-Konjugate: 1:20.000 – 1:400.000
Streptavidin-HRPO: 0,01 – 0,1 µg/ml
Streptavidin-Alk.Phos.: 1 – 2 µg/ml

3. Achtung bei Verwendung von bovinem Milchpulver

Oft wird zur Blockierung von Blots bovines Milchpulver eingesetzt. Manchmal kann auch dies die Quelle unerwünschten Hintergrunds sein.
Um eine Hintergrundreaktion des Sekundärantikörpers mit bovinen Ig im Milchpulver zu vermeiden, ist grundsätzlich die Verwendung von Sekundärantikörpern vorteilhaft, die gegen bovine (MinX Bo) oder humane (MinX Hu) Ig/ Serumproteine adsorbiert wurden.

Weitere Maßnahmen zur Reduktion unspezifischen Hintergrunds sind die Blockierung mit 5% Normalserum aus derselben Spezies wie der Sekundärantikörper oder die Verwendung von IgG-freiem BSA (Kat.-Nr. 001-000-161/2) zum Blocken. Bei problematischen Blots bringt eine Normalserum-Blockierung als einfache Maßnahme oft die saubersten Ergebnisse.

Generell sollte der Sekundärantikörper nur in Puffer ohne Proteinzusatz wie Milchpulver o. a. verdünnt werden, um Reaktionen des Sekundärantikörpers mit Proteinen oder Immunglobulinen im Proteinzusatz auszuschließen. Dies gilt insbesondere für anti-Ziege Konjugate (siehe 4.).

4. Achtung bei Verwendung von Anti-Ziege Konjugaten

Anti-Ziege Sekundärantikörper aus den Wirtsspezies Esel, Kaninchen und Maus reagieren zu einem hohen Grad mit bovinen Immunglobulinen, z. B. in Milchpulver, kreuz. Ist Milchpulver im Sekundärantikörper-Verdünnungspuffer enthalten, kann anti-Ziege Konjugat bereits im Verdünnungspuffer durch bovines Ig „adsorbiert“ werden. Das Konjugat liefert entweder gar kein oder nur in sehr hohen Konzentrationen ein Signal. Außerdem kann es bei diesen Konjugaten zu Hintergrund auf dem Blot kommen, wenn bovines Milchpulver zum Blocken verwendet wurde.

Für den Nachweis von Ziege-Primärantikörpern im Western Blot empfehlen wir daher Rind anti-Ziege (Kat.-Nr. 805-xx5-180). Dadurch, dass der Sekundärantikörper in der sehr nah verwandten Spezies Rind hergestellt wurde, weist er keine Kreuzreaktion mit Rind-Ig / Serumproteinen auf.

5. Endogene Immunglobuline im Probenlysat

Handelt es sich bei der über das Gel aufgetrennten Probe um ein Lysat von Immunglobulin-haltigen Zellen oder Geweben, so sollten Sekundärantikörper ohne Kreuzreaktion (MinX) zur Spezies, aus der das Probengewebe stammt, zum Einsatz kommen. (Alternativ kann dem Verdünnungspuffer des Sekundärantikörpers behelfsweise Normalserum (Ig) derselben Spezies, aus der das Probenmaterial stammt, zugesetzt werden.)

6. Antikörper-Hintergrundbanden bei Immunpräzipitation

Wie Hintergrundbanden durch präzipitierte Immunglobuline beim indirekten Nachweis mit Sekundärantikörpern vermieden werden können, lesen Sie im folgenden Punkt.

Immunoblot (Western Blot) – Vermeidung von Antikörper-Hintergrundbanden

Eines der häufigsten Probleme im Immunoblot (Western Blot) bei indirektem Nachweis mittels Sekundärantikörpern sind Hintergrundbanden aufgrund von Antikörpern in der aufgetrennten Probe, z. B. durch eine vorherige Immunpräzipitation, durch zell- oder gewebeeigene Immunglobuline im Lysat oder durch Verunreinigungen boviner Immunglobuline (FCS in Zelllysaten, BSA u.a.). In reduzierenden SDS-PAGE-Gelen bilden die aus der Probe eluierten schweren und leichten Ketten von Antikörpern Banden bei 50 kDa und 25 kDa. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen bilden Gamma-Immunglobuline (IgG) eine Bande bei ca. 150 kDa.

Antibody_heavy___light_chain_in_WB_02_78008264cb

Am wichtigsten ist die Beachtung dieses Problems bei Immunpräzipitationen (IP), vor allem, wenn die Bande des Zielproteins in diesen Molekulargewichtsbereichen erwartet wird.

Durch die Verwendung direkt markierter Primärantikörper zum Nachweis des Zielproteins auf dem Blot kann das Problem von Antikörper-Hintergrundbanden bei IP komplett umgangen werden. Oft steht jedoch kein Primärantikörper-Konjugat zur Verfügung, so dass ein unkonjugierter Primärantikörper mit einem Sekundärantikörper-Konjugat markiert werden muss.

Eine Möglichkeit, unerwünschte Banden des zur IP verwendeten Antikörpers zu vermeiden, besteht darin, den Antikörper an Protein A/G-Beads quer zu vernetzen oder ihn direkt kovalent an vorbehandelte Beads zu koppeln. Um Antikörper-Verunreinigungen bei dieser Vorgehensweise zu vermeiden, ist es jedoch entscheidend, das Antigen unter nicht-denaturierenden Bedingungen zu eluieren, da ansonsten die denaturierten Antikörperfragmente mit dem Antigen eluiert werden.

Erfolgt der Antigen-Nachweis auf dem Blot über einen unkonjugierten Primärantikörper und ein Sekundärantikörper-Konjugat, lassen sich Antikörper-Banden unter bestimmten Voraussetzungen durch die Wahl des Sekundärantikörpers umgehen:

Die zum Präzipitieren und Nachweisen verwendeten Primärantikörper:

1. stammen aus verschiedenen Wirtsspezies.

Hintergrundbanden des Präzipitations-Antikörpers auf dem Blot können durch Sekundärantikörper, die keine Kreuzreaktion (MinX) zur Spezies des Präzipitations-Antikörpers besitzen, ausgeschlossen werden.

Beispiel: Präzipitation mit polyklonalem Kaninchen anti-Zielprotein, Blot-Nachweis mit monoklonalem Maus anti-Zielprotein
> Sekundärantikörper Anti-Maus IgG (H+L) MinX Kaninchen etc. (z.B. Kat.-Nr. 115-035-146).

Anti-IgG/M (H+L) ohne Spezies-Kreuzreaktion (MinX) für den Western Blot

Viele weitere anti-Ig (H+L)-spezifische Antikörper für den Western Blot unterSekundärantikörper

2. stammen aus gleichen Wirtsspezies und

a. besitzen verschiedene Isotypen.
Durch die Auswahl eines Sekundärantikörpers, der spezifisch für die Sub/Klasse des Nachweis-Primärantikörpers ist, wird der Präzipitations-Antikörper auf dem Blot nicht erkannt.

Beispiel: Präzipitation mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein, Blot-Nachweis mit monoklonalem Maus (IgG2a) anti-Zielprotein
> Sekundärantikörper Anti-Maus IgG2a (z.B. Kat.-Nr. 115-035-206).

Anti-IgG-Subklassen- und Anti-IgM-spezifische Sekundärantikörper für den Western Blot

b. das Zielprotein liegt bei 50 kDa.
Sekundärantikörper gegen die leichten Ketten von Maus Ig/G reagieren im Blot nicht mit der reduzierten und denaturierten schweren Kette (50 kDa) des Präzipitations-Antikörpers. Sie binden nur an die reduzierte, denaturierte leichte Kette des präzipitierten Antikörpers (siehe Abbildung) sowie an die nativen leichten Ketten des Nachweis-Antikörpers. Eine Antikörperbande wird nur im Bereich der leichten Ketten, nicht aber im Bereich des Zielproteins detektiert.

Beispiel: Zielprotein ca. 50 kDa; Präzipitation mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein, Blot-Nachweis mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein
> Sekundärantikörper anti-Maus Ig/G leichte Kette (z.B. Kat.-Nr. 115-035-174).

c. das Zielprotein liegt bei 25 kDa.
Sekundärantikörper gegen das Fc-Fragment der schweren Ketten von Maus IgG reagieren nicht mit der reduzierten und denaturierten leichten Kette (25 kDa) von Antikörpern. Sie binden nur an die reduzierte, denaturierte schwere Kette des präzipitierten Antikörpers sowie an die schwere Kette des nativen Nachweis-Antikörpers. Eine Antikörperbande wird nur im Bereich der schweren Ketten, nicht aber im Bereich des Zielproteins markiert.
Anti-IgG Fc-spezifische Sekundärantikörper erkennen außerdem keine IgM o.a. Ig-Klassen.

Beispiel: Zielprotein ca. 25 kDa; Präzipitation mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein, Blot-Nachweis mit monoklonalem Maus (IgG1) anti-Zielprotein
> Sekundärantikörper anti-Maus IgG Fc (z.B. Kat.-Nr. 115-035-071).

Anti-IgG Fc-spezifische Sekundärantikörper für den Western Blot

Anm.: Erkennt der Nachweis-Primärantikörper sein Zielprotein auch in nicht-reduzierter Form und ist das Zielprotein bezüglich seiner Größe u.a. in der SDS-PAGE darstellbar, kann die Probe ohne reduzierende Reagenzien aufgetragen werden. Der zum Präzipitieren verwendete Primärantikörper bildet dann nur eine Antikörperbande bei 150 kDa, welche den Nachweis von Zielproteinen außerhalb dieses Molekulargewichtsbereichs nicht stört.

Anti-IgG leichte Kette – spezifische Antikörper

Anti-IgG leichte Kette spezifische Antikörper reagieren mit nativen Primärantikörpern, die zur Detektion von Proteinen in Western Blots eingesetzt werden. Bei geeigneter Verdünnung reagieren sie im Blot nicht mit der reduzierten und denaturierten schweren Kette (50 kDa) des IgG-Moleküls. Hierdurch eignen sich die Antikörper hervorragend zur Detektion von Antigenen im Bereich von 50 kDa, wenn die Proben aus Immunpräzipitationsversuchen (IP) stammen, bei denen die denaturierte schwere IgG-Kette das Zielprotein überdecken kann.

Obwohl die anti-leichte Kette spezifischen Antikörper im Western Blot eine starke Reaktivität mit nativen leichten IgG-Ketten zeigt, kann es bei der Erkennung der reduzierten und denaturierten Form zu einer verringerten Sensitivität kommen. Wir empfehlen daher, die Antikörper nicht für eine sensitive / quantitative Detektion von leichten IgG-Ketten im Western Blot einzusetzen.

Um Kreuzreaktionen mit eventuell ebenfalls im Blot vorhandenen Immunglobulinen zu verhindern, wurden die Antikörper gegen Serumproteine aus vielen Spezies adsorbiert.

dianova - Anti-IgG leichte Kette spezifische MinX-Sekundärantikörper - WB

Zielproteine von 25 kDa können nach Immunpräzipitation am besten mit Anti-IgG-Fc-Fragment-spezifischen Antikörpern ohne Signalüberlagerungen in diesem Molekulargewichtsbereich nachgewiesen werden, da diese nicht mit der reduzierten und denaturierten leichten Kette von Antikörpern reagieren.

Abbildungen:

Fig. 1. Lanes 1, 2: detection of primary antibodies made in goat against a 50 kDa target protein; Lanes 3, 4: detection of heavy (50 kDa) and light (25 kDa) chains of reduced and SDS-denatured goat IgG separated by SDS-PAGE; Lanes 5, 6: reduced and SDS-denatured mouse IgG (control).

Fig. 2. Lanes 1-3: reduced and SDS-denatured mouse IgG (control); Lanes 4-8: detection of heavy (50 kDa) and light (25 kDa) chains of reduced and SDS-denatured goat IgG separated by SDS-PAGE.
Lanes 3, 4 (Fig. 1) and Lanes 4-8 (Fig. 2) demonstrate the relatively weak reactivity of the anti-goat light chain specific antibody with reduced and SDS-denatured light chains.

(By: Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)

Fluoreszenzantikörper für den Western Blot

• kompatibel zu LI-COR® Odyssey
• quantitative Western Blots
• In-Gel Western Blots
• In-Cell- und On-Cell Western Arrays
• höchste Sensitivität und Spezifität

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790
Alexa Fluor® 680 ist ein im dunkelroten (far red) Spektrum emittierender Farbstoff (Amax: 684nm / Emax 702nm) und Alexa Fluor® 790 ein Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff (Amax: 783 nm / Emax 803 nm).

An Antikörper gekoppelte Dunkelrot- und Infrarotfarbstoffe sind aufgrund geringerer Quenching-Effekte, höherer Extinktionskoeffizienten der Farbstoffe und geringeren Autofluoreszenzhintergrundes sensitiver als herkömmliche Fluoreszenzfarbstoffe. Die deutlich stärkere Helligkeit erlaubt den Einsatz in einem breiten Spektrum fluoreszenzbasierter Methoden. Hierzu zählen hochsensitive Western Blots, quantitative Western Blots, In-Gel Western Blots, micro Western Arrays, In-Cell- und On-Cell Western Arrays, Gewebeschnitt-Imaging, Ganzkörper-Bildgebungsverfahren und andere Methoden, die eine hohe Leuchtkraft erfordern.

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790 für die Dunkelrot(far red)- und Infrarot-(infrared)-Detektion

Abb. 1: Doppelimmunfluoreszenz-Western Blot mit Alexa Fluor® 680 (far red) und Alexa Fluor® 790 (infrared) gekoppelten Sekundärantikörpern (Verdünnung 1:100.000). Maus (Spur 1)- und Ziegen-IgG (Spur 2) wurden mit ß-Mercaptoehanol reduziert, unter denaturierenden Bedingungen auf einem SDS-Gel aufgetrennt und danach auf einer Nitrozellulosemembran geblottet. Die schweren Ketten wurden anschließend mit Alexa Fluor® 790 gekoppeltem Ziege anti-Maus IgG, Fc-gamma Subklassen 1 spezifischem Antikörper (ohne Kreuzreaktion zu Serumproteinen aus Human, Bovin und Kaninchen) (grün, Kat. Nr. 115-655-205) und die leichten Ketten mit Alexa Fluor® 680 konjugiertem Ziege anti-Maus IgG leichte Kette- spezifischem Antikörpern adsorbiert gegen Serumproteine aus Bovin, Ziege, Pferd, Human, Kaninchen, Ratte und Schaf (rot) nachgewiesen (LiCor Odyssey Imager). Das Ziegen-IgG diente dabei als Hintergrundkontrolle. Beachten Sie, dass sich aufgrund der extremen Helligkeit der Farbstoffe sogar bei einer Verdünnung von 1:100.000 noch schwache Banden der schweren und leichten Kette des Ziegen-IgG abzeichnen (Abb. Jackson ImmunoResearch).

Eigenschaften von Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790

Jackson ImmunoResearch bietet eine große Auswahl an Alexa Fluor® 680- und Alexa Fluor® 790-konjugierten signalverstärkender anti-Biotin, anti-FITC & anti-HRPO Antikörper, affinitätsgereinigten Sekundärantikörpern, Streptavidin-Konjugaten und IgG-Kontrollen für Einzel- und Doppel-Western Blot-Färbungen. Die Sekundärantikörper sind gegen Immunglobuline aus anderen Spezies und Klassen adsorbiert, um eine kreuzreaktionsfreie Doppelmarkierung zu gewährleisten (Abb. 1).

Beide Farbstoffe können mit dem LiCor Odyssey System und allen oben aufgeführten hochsensitiven Methoden eingesetzt werden. Aufgrund der extrem hohen Empfindlichkeit empfehlen wir, die Antikörper in einer Verdünnung von 1:50.000 bis 1:200.000 einzusetzen. Links zu den neuen Produkten direkt in unserem Webshop finden Sie in der Tabelle.

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790-Konjugate

AntispeziesAlexa Fluor 680Alexa Fluor 790
anti-armenischer Hamster127-625-160127-655-160
anti-Huhn703-625-155703-655-155
anti-HumanZiege Anti-Human IgG, Fc (109-625-098)
Ziege Anti-Human IgM, µ-Kette (109-625-129)
Esel Anti-Human IgG (H+L) (709-625-149)
Ziege Anti-Human IgG, Fc (109-655-098)
Ziege Anti-Human IgM, µ-Kette (109-655-129)
Esel Anti-Human IgG (H+L) (709-655-149)
anti-KaninchenZiege Anti-Kaninchen IgG (H+L) (111-625-144)
Maus Anti-Kaninchen IgG, leichte Kette (211-622-171)
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) (711-625-152)
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) (111-655-144)
Maus Anti-Kaninchen IgG, leichte Kette (211-652-171)
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) (711-655-152)
anti-MausZiege Anti-Maus IgG, Fc (115-625-071)
Ziege Anti-Maus IgM, µ-Kette (115-625-075)
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) (115-625-146)
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) (115-625-166)
Ziege Anti-Maus IgG, leichte Kette (115-625-174)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 1 (115-625-205)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 2a (115-625-206)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 2b (115-625-207)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 3 (115-625-209)
Esel Anti-Maus IgG (H+L) (715-625-150)
Esel Anti-Maus IgG (H+L) (715-625-151)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc (115-655-071)
Ziege Anti-Maus IgM, µ-Kette (115-655-075)
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) (115-655-146)
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) (115-655-166)
Ziege Anti-Maus IgG, leichte Kette (115-655-174)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 1 (115-655-205)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 2a (115-655-206)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 2b (115-655-207)
Ziege Anti-Maus IgG, Fc gamma 3 (115-655-209)
Esel Anti-Maus IgG (H+L) (715-655-150)
Esel Anti-Maus IgG (H+L) (715-655-151)
anti-Meerschwein703-625-155703-655-155
anti-RatteZiege Anti-Ratte IgG, Fc (112-625-071)
Ziege Anti-Ratte IgM, µ-Kette (112-625-075)
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) (112-625-143)
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) (112-625-167)
Ziege Anti-Ratte IgG, leichte Kette (112-625-175)
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) (712-625-150)
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) (712-625-153)
Ziege Anti-Ratte IgG, Fc (112-655-071)
Ziege Anti-Ratte IgM, µ-Kette (112-655-075)
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) (112-655-143)
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) (112-655-167)
Ziege Anti-Ratte IgG, leichte Kette (112-655-175)
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) (712-655-150)
Esel Anti-Ratte IgG (H+L) (712-655-153)
anti-SchafMaus Anti-Schaf IgG, leichte Kette (213-622-177)
Esel Anti-Schaf IgG (H+L) (713-625-147)
Maus Anti-Schaf IgG, leichte Kette (213-652-177)
Esel Anti-Schaf IgG (H+L) (713-655-147)
anti-ZiegeMaus Anti-Ziege IgG, leichte Kette (205-622-176)
Esel Anti-Ziege IgG (H+L) (705-625-147)
Maus Anti-Ziege IgG, leichte Kette (205-625-176)
Esel Anti-Ziege IgG (H+L) (705-655-147)

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790-Streptavidin

KonjugatAlexa Fluor 680Alexa Fluor 790
Streptavidin016-620-084016-650-084

Alexa Fluor® 680 und Alexa Fluor® 790-Kontrollen

KonjugatAlexa Fluor 680Alexa Fluor 790
Esel IgG-Gesamtmolekül017-620-003017-650-003
Maus IgG-Gesamtmolekül015-620-003015-650-003
Ziege IgG-Gesamtmolekül005-620-003005-650-003

Abb. 2 : Normalisierte Darstellung der Anregungs- und Emissions-Spektra der neuen Alexa Fluor® 680- (links) und Alexa Fluor® 790 (rechts)-konjugierten Sekundärantikörper, gemessen mit einem M-Serien Spektrofluorometer von Photon Technology International, Inc. und einem Ultraspec 1100 pro von Amersham Biosciences (Abb. Jackson ImmunoResearch).

Hier geht es zu unserem Western Blot Troubleshooting Guide.

Immunhistochemische Färbung von Mausantikörpern auf Mausgewebe

Der indirekte Nachweis von Maus-Primärantikörpern auf Mausgeweben wird oft durch hohe Hintergrundfärbung erschwert. Das Hauptproblem ist, dass der Anti-Maus Sekundärantikörper bei indirekten Nachweismethoden nicht zwischen endogenen Maus-Immunglobulinen im Probengewebe und dem Maus-Primärantikörper zu unterscheiden vermag.

Endogene Immunglobuline sind hauptsächlich in löslicher Form im interzellulären Raum verteilt und verursachen insbesondere Probleme beim Nachweis von Antigenen, die nahe der Zelloberfläche oder in der extrazellulären Matrix lokalisiert sind.

Darüber hinaus finden sich gewebeeigene Immunglobuline auf der Zelloberfläche von Lymphozyten. Die Höhe des Hintergrunds hängt vom Gewebetyp ab und variiert von Probe zu Probe. Das Problem tritt oft in Geweben aus Muskel, Haut und Niere auf.

Endogene Immunglobuline sind nicht die einzige Ursache für erhöhten Hintergrund bei Maus-auf-Maus Färbungen.

So können u. a. auch endogene Peroxidase-Aktivität im Probengewebe oder Fc-Rezeptoren einen Einfluss haben.Peroxidase-Aktivität kann durch einen Blockierungsschritt vor der Blockierung mit Normalserum oder nach der Primärantikörperinkubation inhibiert werden.

Die Bindung des Sekundärantikörpers an Fc-Rezeptoren von Zellen und Geweben lässt sich einerseits durch eine geeignete Blockierung mit Normalserum oder speziellen Fc-Rezeptor-Blockierungslösungen verhindern. Setzt man Fab(2)-Fragmente als Sekundärantikörper ein, schließt man ein Binden an Fc-Rezeporen komplett aus.

Blockierung endogener Immunglobuline mit Fab-Fragmenten

RTEmagicC_EndogeneIgGs.jpg

Eine besonders effiziente Methode, die Hintergrundfärbung endogener Immunglobuline bei indirekten Nachweismethoden zu verhindern, ist die Vorinkubation des Probengewebes mit Fab-Fragmenten unkonjugierter anti-Maus Antikörper. Diese Methode kann ohne weiteres auch auf den indirekten Nachweis (Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, Zytometrie) von Primärantikörpern anderer Spezies auf homologen Geweben und Zellen übertragen werden.

Beispielprotokoll zum Blockieren von endogenen Immunglobulinen mit Fab-Fragmenten auf Mausgewebe.


IHC Antikörper – Maushistologie

IHC-validierte Marker für die Maushistologie – Speziell entwickelt für Formalin-fixiertes Paraffingewebe (FFPE) der Maus!
Antikörper für die Maushistologie


Monovalente Fab-Fragmente zum Blockieren

Fab anti-Maus
Fab anti-Ratte
Fab anti-Human
Fab anti-Kaninchen

Mehr Informationen


Immunhistochemische Färbung von Mausantikörpern auf Rattengewebe

Sekundärantikörper gegen Maus IgG reagieren aufgrund der hohen Homologie zwischen Maus und Ratte mit IgG von Ratte kreuz und können daher unerwünschte Hintergrundmarkierung endogener Ratte-Immunglobuline im Probengewebe verursachen.

Endogene Immunglobuline befinden sich im interzellulären Raum und verursachen insbesondere Probleme beim Nachweis von Antigenen, die nahe der Zelloberfläche oder in der extrazellulären Matrix lokalisiert sind. Die Höhe des Hintergrunds ist vom Gewebetyp und der einzelnen Probe abhängig. Das Problem tritt oft in Geweben aus Muskel, Haut und Niere auf.

Eine Methode, die Hintergrundfärbung endogener Immunglobuline beim indirekten Nachweis von Mausantikörper auf Mausgewebe zu verhindern, finden Sie hier.

Eine einfachere Vorgehensweise zur Verhinderung von Hintergrundfärbung durch gewebeeigene Immunglobuline besteht in der Auswahl von Sekundärantikörpern, bei denen die Kreuzreaktivität gegen die zur Wirtsspezies des Primärantikörpers homologen Spezies minimiert ist (MinX).
Bei der Markierung von Maus-Primärantikörpern auf Rattengeweben sind Anti-Maus MinX Ratte-Sekundärantikörper erforderlich.

Zur Färbung auf Rattengewebe dem Beispielprotokoll folgen, Schritt 7./8. weglassen und in Schritt 11. z. B. Kat-Nr. 115-035-166 einsetzen.Hinweis: Augrund der Adsorption gegen eine eng verwandte Spezies können monoklonale Primärantikörper, die seltenere IgG-Subklassen besitzen (IgG2b, IgG3), teilweise nicht mehr so gut erkannt werden. Die Sensitivität eines gegen Ig einer homologen Spezies adsorbierten Sekundärantikörpers ist vermindert. Dies gilt insbesondere für Anti-Maus (adsorbiert gegen Ratte), Anti-Ratte (adsorbiert gegen Maus) oder Anti-(arm.)Hamster (adsorbiert gegen Maus, Ratte).

Wenn es nicht unbedingt erforderlich ist, Primärantikörper einer Spezies (z.B. Maus) in der Gegenwart einer anderen, eng verwandten Spezies (z.B. Ratte) nachzuweisen, sollte die Wahl eines gegen eng verwandte Spezies adsorbierten Sekundärantikörpers daher vermieden werden.