Anti-CD31 für Mausgewebe (FFPE): Klon SZ31 ist der Goldstandard.

Der anti-msCD31 Antikörperklon SZ31 (DIA-310) ist ein weltweit einzigartiger Goldstandard für den Nachweis von Endothelzellen auf Formalin-fixiertem Paraffin-Gewebe der Maus und für Angiogenesestudien. Vertrauen Sie mehr als 200 wissenschaftlichen Publikationen auf CiteAb.

CD31 ist der wichtigste Marker für Endothelzellen und für Studien der (Neo-) Angiogenese z.B. bei Tumoren. Der Antikörperklon SZ31 (# DIA-310) ist der einzige Antikörper, der spezifisch mit murinem CD31 in routinemäßigen Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten der Maus reagiert. Der Antikörperklon SZ31 zeigt keine Kreuzreaktivität mit humanem CD31. Dieser CD31-Nachweis ist äußerst wichtig für die Forschung und präklinische Angiogenesestudien in Mausmodellen, beispielsweise an menschlichen Tumor-Xenotransplantaten. Seit seiner Einführung im Jahr 2010 wurde der Klon SZ31 in zahlreichen wissenschaftlcihen Arbeiten von vielen verschiedenen Laboren weltweit publiziert und gilt deshalb als „Goldstandard“ für Studien zur Angiogenese in Mausmodellsystemen


Immunohistochemischie von Maus CD31 (PECAM-1) in Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten Gewebeschnitten.

Der Antikörperklon SZ31 färbt spezifisch Endothelzellen in Gefässen und Kapillaren verschiedener  Mausgewebe.

Aorta, msCD31
Mesenteric vessels, msCD31
Small intestine, msCD31
Small intestine, msCD31
Adenosarcoma, msCD31
Spinal cord, msCD31
Liver, msCD31
Muscle, msCD31
Lung, msCD31

Funktion und Rolle des Endothelzell-Markers CD31 in der Maus-Histologie.

CD31, auch bekannt als PECAM-1 (Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1), wird konstitutiv auf der Oberfläche von embryonalen und adulten Endothelzellen exprimiert. CD31 zeigt sich auch auf Zelloberflächen von Monozyten, Neutrophilen, Blutplättchen und bestimmten T-Zell-Untergruppen und wurde zudem an hämatopoetischen Stammzellen und embryonalen Stammzellen aus Knochenmark nachgewiesen. Differenzierungscluster 31 (CD31) ist ein integrales Membranglykoprotein mit 130 kDa und gehört zur Immunglobulin-Superfamilie, die an der Vermittlung der Zell-Zell-Adhäsion beteiligt ist. CD31-vermittelte Endothelzell-Zell-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle bei der Angiogenese. Verschiedene Studien konnten zeigen, dass CD31 der beste marker für den Angiogenese-Nachweis beim Menschen ist und darüber hinaus Aussagen über ein möglcihes Wiederauftreten von Tumoren erlaubt. Pathophysiologische Studien von CD31 in Maus-Modellsystemen konnten an Formalin-fixierten Gewebeschnitten (FFPE) lange Zeit kaum durchgeführt werden. Erst der Klon SZ31 (Anti-CD31) hat diese Einschränkungen beseitigt, da er die einwandfreie immunhistochemische Analyse an standardmässig Formalin-fixierten Paraffinschnitten von Mausgewebe ermöglicht.


Neu: Direkter Nachweis von 6His getaggten Proteinen direkt auf der Membran mit HisDirect

Nur für kurze Zeit: His-Tag Antikörper Bestellen und 3 HisDirect Pads gratis erhalten:

Zeitsparender, sensitiver Nachweis ohne zusätzliches Detektionsreagenz (ECL)

Der anti-His-Tag Antikörper Klon 13/45/31-2 (monoklonal Maus Isotyp IgG1) wurde für den Nachweis von His-Epitop-Tags (Hexa Histidine, His6) in Zellen und komplexen Zelllysaten entwickelt und detektiert N-/C-terminale sowie interne His-Tags mit der ungewöhnlich hohen Affinität.

Mit den neuen HisDirect 60nm Gold Konjugaten an anti-Histag Antikörper können Sie 6His-markierte Proteine direkt auf der Membran nachweisen. Das Verfahren eignet sich sowohl für Western Blot Nitrocellulose und PVDF Membranen und kann auch für Kolonie und Plattentests von Bakterien eingesetzt werden.

Es reduziert die Schritte Antikörperbindung, Waschen und Detektieren auf einen einzigen Schritt, der in der Regel binnen 10 bis 60 Minuten abgeschlossen ist. Es wird kein sekundärer Antikörper benötigt und auch der Einsatz von zusätzlichen teuren Detektionsreagenzien, wie ECL entfällt.

Vergleich herkömmlicher Detektionsmethoden und His-Direct unter Verwendung von Lysaten zweier High Five® Insekten Zellkultur Expressionsansätze. Der Pfeil markiert das Zielprotein. Links: Coomassie Färbung (3 h); Mitte: HRP-anti- Penta-His Antikörper mit ECL Reagenz (4 h); Rechts: His Direct pMolRange (20 Minuten)

HisDirect gibt es als ready-to-use Reagenz oder als praktische Pads:

BestellnummerMengeBeschreibung
HisDirect-PA-01010 Pads HisDirect His-Tag WB Staining Pads (10x) pmol/fmol-Range (RUO)
HisDirect-PA-030 30 Pads HisDirect His-Tag WB Staining Pads (30x) pmol/fmol-Range (RUO)
HisDirect-LP-010 10x10ml HisDirect His-Tag WB Staining Solution pmol-Range ready-to-use (RUO)
HisDirect-LF-010 10x10ml HisDirect His-Tag WB Staining Solution fmol-Range ready-to-use (RUO

Quantifizierung von DotBlots mit HisDirect:

Dot-Blot zur quantitativen Bestimmung der Proteinmenge eines His6-markierten 11 kDa Proteins. Der Rahmen markiert den linearen Nachweisbereich. Links: Auf einem Nitrocellulosestreifen wurden je 0,5 µL einer Proteinverdünnungsreihe für 90 min in 10 mLHisDirect pmolRange Fertigreagenz inkubiert, anschließend getrocknet und fotografiert und das Foto in Graustufen umgewandelt; Mitte: aufgetragene Proteinmenge; Rechts: Korrelation zwischen Signalintensität und Proteinmenge zur Quantifizierung mit Hilfe der Proteinverdünnungsreihe Oben: Im Quantifizierungsprogramm ermittelte Signalintensität aus dem Graustufenbild in Bezug zur aufgetragenen Proteinmenge. Innenliegend: Der lineare Bereich liegt zwischen einer Proteinmenge von 6,35 pmol und 50 pmol bzw. 69 ng und 0,55 µg.

weitere His-Tag Antikörperformate und Resourcen:

Blockieren von endogenen Immunglobulinen mit Fab-Fragmenten auf Mausgewebe – Beispielprotokoll

Probenmaterial vorbereiten: Paraffinschnitte hydrieren und Antigendemaskierung nach Herstellerangaben für den Primärantikörper durchführen, Gefrierschnitte fixieren und in Puffer waschen, Zellen in Puffer waschen, fixieren und nochmals waschen.

Waschen: 2 x 5 Minuten mit TBS.

  1. Optional: Gewebeschnitte durch Inkubation mit 1% TX-100 in TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorreinigen.
  2. Beseitigung endogener Peroxidaseaktivität in 0,6% H2O2 in TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
    Hinweis: alternativ gebrauchsfertige Peroxidase-Blockierungslösung von dianova verwenden (ACA500(IVD)ACA999(IVD)).
  3. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  4. Blockierung mit Normalserum: Inkubation der Zellen / Schnitte mit 5% Normalserum in TBS (+ 0,3% TX-100) für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindungsstellen für nachfolgend eingesetzten Antikörper zu blockieren.
    Hinweis: Normalserum aus derselben Spezies wie die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers (z. B. Ziegenserum, Kat.-Nr. 005-000-121).
  5. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  6. Blockierung endogener Maus-Immunglobuline: Zellen / Schnitte mit 20µg – 100 µg/ml unkonjugierten Fab-Fragmenten anti-Maus IgG (H+L) in TBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
    Hinweis: 1. Fab-Fragmente aus derselben Spezies wie die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers (z. B. Fab Ziege anti-Maus IgG (H+L), Kat.-Nr. 115-007-003). 2. Die Blockierungseffizienz kann über die Konzentration der Fab-Fragmente und über die Inkubationszeit (2 Stunden bei Raumtemperatur oder Übernachtinkubation bei 4°C) erhöht werden.
  7. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  8. Primärantikörper-Inkubation: Zellen / Schnitte mit nach Herstellerangaben verdünntem Maus-Primärantikörper für 30 – 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Verdünnung in TBS/1%BSA oder in Normalserum-Blockierungslösung (5.).
  9. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  10. Sekundärantikörper-Inkubation: Zellen / Gewebeschnitte mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper in TBS entsprechend Verdünnungsempfehlung des Herstellers (ca. 0,2 – 2 µg/ml) für 30 – 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (z. B. Ziege anti-Maus IgG (H+L), Kat.-Nr. 115-035-062115-035-146115-035-166).
  11. Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
  12. Substrat-Inkubation: für 3 – 7 Minuten in der Substratlösung (z. B. DAB) bei Raumtemperatur inkubieren (Kat.-Nr. ACH500 (IVD)ACT500(High Contrast, IVD).
  13. In Leitungswasser spülen.
  14. Mit Hämatoxylin gegenfärben, falls erwünscht (Kat.-Nr. HAQ500).
  15. In destilliertem Wasser 3 x 5 Minuten spülen.
  16. Lufttrocknen lassen und mit permanentem Eindeckmedium eindecken (Kat.-Nr. PMT030).

Hinweise:

  1. Statt TBS als Puffer für Blockierungs-, Wasch- und Antikörperverdünnungslösung kann auch PBS eingesetzt werden. TBS kann für einen geringeren Hintergrund vorteilhafter sein als PBS.
  2. Eine Hintergrundfärbung von Probenmaterial kann nicht nur eine Ursache haben. So können u. a. auch endogene Peroxidase-Aktivität im Probengewebe oder Fc-Rezeptoren einen Einfluss haben. Peroxidase-Aktivität wird durch einen Blockierungsschritt vor der Blockierung mit Normalserum oder nach der Primärantikörperinkubation inhibiert. Die Bindung des Sekundärantikörpers an Fc-Rezeptoren von Zellen und Geweben lässt sich einerseits durch eine geeignete Blockierung mit Normalserum oder speziellen Fc-Rezeptor-Blockierungslösungen verhindern, andererseits durch die Verwendung von F(ab’)2-Fragment-Sekundärantikörpern (z. B. in Schritt 11. F(ab’)2 Ziege anti-Maus IgG(H+L), Kat.-Nr. 115-036-062).

anti-Hapten Konjugate für FISH

Blockierung heterophiler Antikörper (HAMA)

Ungewollte Kreuzreaktivitäten führen immer wieder zu falschen Ergebnissen in diagnostischen Immunoassays. Insbesondere heterophile Antikörper (Antikörper, die mit weiteren Antigene als dem spezifischen Antigen kreuzreagieren), wie Rheumafaktoren oder Human-Anti-Maus-Antikörper (HAMA), können eine Ursache sein.

HAMA Blocker ImmunoRegeants
ImmunoReagents Bulk Immunglobuline

Hochreine Immunglobuline (IgGs) von ImmunoReagents ermöglichen eine zuverlässige Blockierung heterophiler Antikörper. Störeffekte bei der Analyse humaner Proben werden hiermit vermieden und reproduzierbare Ergebnisse erzielt. Mit weniger Falsch-positiven oder Falsch-negativen Ergebnissen wird die Qualität und Wettbewerbsfähigkeit von Diagnosekits erheblich verbessert.

Gereinigte Immunglobuline (Protein A oder Protein G) für die Blockierung heterophiler Antikörper sind in verschiedenen Verpackungsgrößen (mg – g) erhältlich. Konzentration: 8-12 mg/ml.

Jedes Produkt wird strengen Qualitätskontrollen unterzogen, um eine überdurchschnittliche Performance zu gewährleisten.

Bulk IgG HPLC Analyse ImmunoReagents

Repräsentatives HPLC-Profil für ImmunoReagents’ IgGs: Die effektiven HAMA Blocker zeichnen sich durch eine hohe Qualität und Reinheit (95% basierend auf SDS-Page) aus.

Wir bieten Ihnen kostengünstige und verlässliche HAMA Blocker in unterschiedlichen Verpackungsmengen (auch Bulk):

wdt_IDKat.-Nr.ProduktbeschreibungMengePreis* [EUR]
1Dk-003-ZEsel IgG, Protein G-gereinigt10mg115.00
2Gt-003-ZZiege IgG, Protein G-gereinigt10mg123.00
3Ha-003-Z.1Hamster IgG, Protein G-gereinigt1gPreis auf Anfrage
4Ha-003-Z.01Hamster IgG, Protein G-gereinigt100mg318.00
5Ha-003-Z.05Hamster IgG, Protein G-gereinigt500mg559.00
6Hu-003-C.1Human IgG, Protein A-gereinigt1gPreis auf Anfrage
7Hu-003-C.01Human IgG, Protein A-gereinigt100mg318.00
8Hu-003-C.05Human IgG, Protein A-gereinigt500mg559.00
9Hu-003-CHuman IgG, Protein A-gereinigt10mg156.00
10Mu-003-C.1Maus IgG, Protein A-gereinigt1gPreis auf Anfrage

Bulk-Mengen erhältlich. Bitte nehmen Sie Kontakt mit uns auf.

Abbildungen mit freundlicher Genehmigung von ImmunoReagents Inc.

*Preise Stand Juni 2019, Preisänderungen vorbehalten

Biotin-vermittelte Signalverstärkung in der IHC

Biotin (= Vitamin H) ist ein stabiles, relativ kleines Molekül das nicht-kovalent an Avidin (ein Protein aus dem Hühnereiweiß) oder Streptavidin (ein Protein aus Streptomyces avidinii) bindet. Diese Interaktion erfolgt mit einer sehr hohen Affinität und kann für eine Signalamplifikation in verschiedenen Immunoassays, wie der Immunhistochemie (IHC), genutzt werden.

Biotin-konjugierte Sekundärantikörper

Biotin-SP (long spacer) ist der Handelsname von Jackson ImmunoResearch für Biotin mit einem langen Spacer (6 Atome), der sich zwischen dem Molekül und konjugierten Protein befindet (siehe Abbildung). In Enzym-Immunoassays (EIA) kann durch die Kombination von Biotin-SP konjugierten Sekundärantikörpern und Streptavidin-Alkalische Phosphatase (ALP) oder Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP) eine signifikante Steigerung der Sensitivität, im Vergleich zu direkt (ohne Spacer) gekoppelten Antikörpern, erreicht werden. Der Linker (22.4 Ä.) verlängert den Abstand zum Sekundärantikörper, wodurch die Proteinoberfläche zugänglicher für das Streptavidin-Enzymkonjugat ist.

Biotin-SP Konjugate Jackson ImmunoResearch
Biotin-SP Molekül. Molekulargewicht 454,54 Da, Linker 22,4 Ä. (Abbildung: Jackson ImmunoResearch)
Biotin-konjugierter Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch
IHC mit biotinylierten Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) (711-065-152) Sekundärantikörper, gefolgt von Streptavidin-HRP (016-030-084). DAB wurde als Substrat verwendet. (Abbildung: Jackson ImmunoResearch)

Für die Visualisierung von biotinylierten Sekundärantikörpern werden weitere Reagenzien benötigt. Sie finden bei uns Streptavidin und Anti-Biotin Antikörper an Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme konjugiert.

Literatur:

  • Jackson ImmunoResearch: Katalog 2019
  • Mulisch, M. & Welsch, U. Romeis – Mikroskopische Technik. (Springer-Verlag, 2015).

LigaTrap™ Antikörperaufreinigung

Die Aufreinigung von Antikörpern erfolgt seit vielen Jahren mittels Protein A oder Protein G Chromatographie. Unser Partner LigaTrap™ Technologies bietet ein neuartiges und patentiertes Portfolio von Affinitätsliganden an. Diese sind speziell für die Aufreinigung von monoklonalen und polyklonalen Immunglobulinen entwickelt. Neben den Spezies-spezifischen Liganden (Humanes IgM, Maus IgG (alle Isotypen), Huhn IgY uvm.) bieten diese Produkte einen weiteren Vorteil für die Antikörperreinigung. Gebundene Antikörper werden, im Gegensatz zu traditionellen Protein A und G-Säulen (pH ≤ 3.0), mit einem milden pH (pH 4.0) eluiert. Dadurch verringert sich die Gefahr, dass pH-sensitive Antikörper präzipitieren und inaktiviert werden. Wir bieten die Produkte in drei Varianten an: ready-to-use Kits, einzelne Resins (Säulenmaterial) oder als vorgepackte Säulen (Purification Column).

Direkt zum den Produkten

Aufreinigung vom Human-IgM-Antikörper

IgM monoklonale Antikörper erfahren ein immer größeres Interesse aus den Bereichen Forschung und Diagnostik, zudem gelten sie als zukünftige Kandidaten für Therapeutika. Leider sind die meisten Liganden für die Aufreinigung von Antikörpern, wie Protein A, nicht für alle Immunglobulin-Subklassen gleichwertig geeignet. Daher wird IgM oft als „das vergesse Immunglobulin“ bezeichnet. Mit den Produkten von LigaTrap™ erhalten Sie die erste schnelle und kostengünstige Methode, um IgM-Antikörper sauber aufzureinigen. Erfahren Sie in diesem Whitepaper mehr über die Vorteile der IgM Aufreinigung mit LigaTrap™ Produkten.

Hier finden Sie weitere Informationen zur Aufreinigung von Human- oder Maus-IgM-Antikörper.

Human IgM Purification - LigaTrap LT-143

IgY: Aufreinigung aus Hühner-Serum

Das Immunglobulin Y wird aus Serum oder Eiern von Hühnern isoliert. Für die Aufreinigung von IgY ist die Produktion in Hühnereiern, aufgrund der hohen Lipidkonzentration im Eigelb, hinderlich. Zudem bindet IgY nicht an Standard IgG-Resins wie Protein A oder Protein G. Mit LigaTrap™ Huhn IgY Purification Kit wird das aufwendige und zeitintensive Verfahren zur Immunglobulin-Aufreinigung stark vereinfacht, Antikörper können jetzt direkt aus dem Serum isoliert werden.

Mehr Informationen zum Huhn IgY Isolationskit LT-142Kit.

Chicken IgY Purification - LigaTrap

IgG1, IgG2 und IgG3: Aufreinigung aus Lama-Serum

Lamas (Lama glama) gehören zusammen mit Alpakas und Guanakos zu der Familie der Camelidae. Innerhalb der Säugetieren weisen Antikörper aus Kamelen eine Besonderheit auf: Im Serum befindet sich neben dem IgG1, mit einer klassischen Immunglobulin-Struktur (zwei leichte- und zwei schwere Ketten), auch die Schwere-Ketten-Antikörper IgG2 und IgG3. Diese besitzen keine leichten Ketten und sind daher kleiner (94 kDa, Lama) als normale IgG Antikörper (150kDa). Mit LigaTrap™ Lama IgG Purification Kit und Resins werden alle drei IgGs aus dem Serum isoliert.

Scheme of IgG-subtypes

Vorgepackte Säulen für die Antikörperaufreinigung

Die loose Resin Produkte von LigaTrap™ sind als vorgepackte Säulen verfügbar. Die FPLC-Chromatographie Säulen sind geeignet für den Einsatz in AKTA™ und anderen Proteinaufreinigungssystemen.

Verfügbare Größen: 1 mL, 5 mL und 3×1 mL

Fließraten: 1 mL Säule: 0.1 – 2.0 mL / min ; 5 mL Säule: 1.0 – 5.0 mL / min

LigaTrap Mouse IgM prepacked Column

Gesamtübersicht

LigaTrap™ Produkte zur Antikörperaufreinigung sind für verschiedene Spezies und Isotypen erhältlich. Sie haben die Wahl zwischen Ready-to-Use Kits, Resin (Säulenmaterial) und vorgepackten Säulen (1x1ml, 3x1ml und 1x5ml). Einen Überblick erhalten Sie in der unten stehenden Tabelle oder direkt auf unsere Suchseite für LigaTrap™ Produkte.

Western Blot Troubleshooting Guide

Der Western Blot gehört zu den Routinetechniken in der heutigen Zell- und Molekularbiologie. Trotzdem kommt es bei der Auswertung der Daten immer wieder zu Schwierigkeiten, da die Ergebnisse nicht eindeutig sind. Die Ursachen können verschiedenster Natur sein. In diesem Ratgeber haben wir für Sie die häufigsten Probleme und deren Lösungsansätze zusammengestellt.

Häufig werden die falschen Antikörper verwendet. In unseren Webshop finden Sie die richtigen Primärantikörper und Sekundärantikörper, wählen Sie hierfür in der Rubrik Anwendung das Stichwort „Western Blot“ aus. Bei weiteren Fragen helfen Ihnen unsere Experten gerne weiter.

Werden Sie mit unserem Troubleshooting Guide zum Western Blot-Experten:

Kein Signal/ Geringe Sensitivität

Problem

Analyt wird nicht detektiert.

Lösung / Ursachen

  • Überprüfen Sie die eingesetzte Proteinmenge: Bradford-Test; BCA-Methode
  • Erhöhen Sie die Proteinkonzentration
  • Verwenden Sie, wenn möglich, eine Positivkontrolle, in der das Antigen hoch exprimiert ist.
  • Verwenden Sie einen frischen LysepufferGeben Sie einen Protease-Inhibitor zum Probenpuffer
  • Lagern Sie Ihre Proben auf Eis (4°C)

Analyt läuft während der Elektrophorese aus dem Gel.

  • Stellen Sie anhand des Größenmarker sicher, dass das gewünschte Protein (kDa) noch im Gel vorhanden ist.
  • Reduzieren Sie die Dauer der Gelelektrophorese

Kein Transfer vom Trenngel auf Membran

  • Überprüfen Sie, ob ein Transfer vom Gel auf die Membran erfolgt ist: Ponceau S Staining
  • Stellen Sie anhand einer Ladekontrolle (Housekeeping) sicher, dass der Transfer gleichmäßig erfolgt ist.

Falsche Transfermembran verwendet

PVDF

  • Eine PVDF Membran muss vor Gebrauch mit Methanol aktiviert werden.
  • Höhere Bindeeigenschaften (170 bis 200 μg/cm2)
  • Kann zu mehr Hintergrund führen als bei einer Nitrocellulose Membran
  • Ist geeignet für das Verwenden von Stripping-Puffern und anschließender Inkubation mit neuen Antikörpern („reprobing“)

Nitrocelluse

  • Geringe Bindeeigenschaften (80 bis 100 μg/cm2)
  • Weniger Hintergrund

Wählen Sie die richtige Porengröße für Ihr Analyt:

  • 0.1, 0.2 oder 0.45μm. (0,45μm eignet sich für die meisten Anwendungen (≥ 20kDa))

Transferbedingungen

  • Während des Transfers muss ein luftblasenfreier Kontakt zwischen Membran und Gel bestehen.
  • Verringern Sie die Transferzeit oder Spannung („Over transfer“).

Dauer der Blockierung

Reduzieren Sie die Inkubationszeit

  • 1h bei Raumtemperatur

Wahl des Blockierungsreagenz

Antigen Maskierung

  • Verwenden Sie eine niedrigere Konzentration
  • Verwenden Sie einen anderen Puffer

Wir empfehlen für das Blockieren 5% Normalserum aus der Spezies zu verwenden, aus der der Sekundärantikörper stammt. Alternativ IgG-freies BSA.

Zu starkes waschen

  • Verringern Sie die Zeit und Anzahl der Waschschritte
  • 3x 5 Min (RT)
  • Verringern Sie die Konzentration an Detergenz
  • 0.1-0.5% Tween 20

Falscher Primärantikörper

Stellen Sie sicher, dass der Primärantikörper für Western Blot geeignet ist (Datenblatt)

Inkubationszeit (Primärantikörper)

Verlängern Sie die Inkubationszeit

  • Über Nacht bei 4°C

Antikörperkonzentration zu niedrig

  • Überprüfen Sie die verwendete Antikörperkonzentration.
  • Überprüfen Sie die Affinität
  • Setzen Sie zunächst eine höhere Konzentration ein als im Datenblatt angegeben. Anschließend wird die Konzentration schrittweise verringert.

Falscher Sekundärantikörper

Prüfen Sie, ob der eingesetzte Sekundärantikörper den verwendeten Primärantikörper binden kann (Datenblatt)

Sekundärantikörper-Konjugat (HRP) beeinträchtigt

  • Verwenden Sie kein Sodium Azide im Puffer. Dieses inhibiert die Reaktion des HRP (Horseradish peroxidase)-Konjugates.
  • Verwenden Sie kein Glycerol mit einem ACS grad von unter 99,5%. Dieses inhibiert die Reaktion des HRP (Horseradish peroxidase)-Konjugates.
  • Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen oder Einfrieren Ihrer Sekundärantikörper.
  • Antikörperlösungen sollten aliquotiert werden

Tipps zur Lagerung von Antikörpern

ECL Reagenz abgelaufen

Verwenden Sie eine neue ECL Reagenz

ECL Reagenz kontaminiert

Verwenden Sie eine neue ECL Reagenz

Belichtungszeit

  • Abhängig von dem Antigenexpressionslevel, kann die notwendige Belichtungszeit variieren.
  • Erhöhen Sie in kleinen Schritten die Belichtungszeit

Starker Hintergrund

Problem

Lösung / Ursachen

Hohe Antigen-Expression

Verringern Sie die Proteinkonzentration

Wahl des Blockierungsreagenz

  • Milchpulver ist nicht geeignet, wenn phosphorylierte Proteine detektiert werden sollen.
  • Der Primärantikörper kann mit dem enthaltenen Casein kreuzreagieren.
  • Milchpulver ist nicht geeignet, wenn Strepavidin/Avidin Konjugate verwendet werden.
  • Milch enthält endogenes BiotinBSA und Milchpulver sind nicht geeignet, wenn Anti-Ziege/ Rind oder Schaf Sekundärantikörper verwendet werden.
  • BSA und Milch können Immunglobuline aus dem Rind enthalten, womit die o.g. Sekundärantikörper kreuzreagieren.

Wir empfehlen für das Blockieren 5% Normalserum aus der Spezies zu verwenden, aus der der Sekundärantikörper stammt. Alternativ IgG-freies BSA.

Inkubationszeit (Blockierungsreagenz)

Erhöhen Sie die Inkubationszeit

  • 1h bei Raumtemperatur

Falsche Konzentration des Primärantikörper

  • Verringern Sie die Konzentration des Primärantikörpers
  • Verdünnungsreihe

Falsche Konzentration des Sekundärantikörper

  • Verringern Sie die Konzentration des Sekundärantikörpers
  • Verdünnungsreihe

Belichtungszeit

Reduzieren Sie schrittweise die Belichtungszeit.

Transfermembran

  • Verwenden Sie Pinzetten für die Membran
  • Lassen Sie die Membran nicht austrockenen

Detektionsreagenz

Reduzieren Sie die Substratkonzentration

Unspezifische Banden oder Punkte auf dem Blot

Problem

Lösung / Ursachen

Protein ist degradiert

  • Verwenden Sie ein frisches Lysat
  • Lagern Sie Ihre Proben auf Eis (4°C)
  • Geben Sie einen Protease Inhibitor zum Probenpuffer

Zustand der Probe

  • Andere Isoform wird detektiert
  • Posttranslationale Modifikation
  • Einfluss auf Molekulargewicht, mögliche Entstehung von Doppelbanden
  • Verwenden Sie, wenn möglich, eine negative Kontrolle
  • Verwenden Sie, wenn möglich, eine positiv Kontrolle
  • Bakterielle Kontamination der Probe/ im Puffer
  • Verwenden Sie deionisiertes Wasser

Transfermembran

  • Entfernen Sie vor dem Transfer alle Luftblasen zwischen Gel und Membran.
  • Waschen Sie die Membran kurz nach dem Transfer, vor dem Blocken, um mögliche Reste von Gel und/oder SDS-Partikel zu entfernen.

Primärantikörper

  • Prüfen Sie, ob der Primärantikörper spezifisch bindet.
  • Verwenden Sie in einer Kontrolle nur den Sekundärantikörper, ohne Primärantikörper.
  • Optimieren Sie die Antikörperkonzentration

Exosomen: Nachweis und Quantifizierung

Als Vesikel zum Transport molekularer Informationen (mRNA, miRNA, Proteine, Lipide) von Sender- zu Empfängerzelle stehen Exosomen im Fokus der Forschung. Insbesondere der molekulare Mix von RNA und Proteinen als Botschaft über den aktuellen Zustand der Genexpression stehen im Vordergrund des Interesses bei der Untersuchung der interzellulären Kommunikation, der Exosomen-Funktion oder der Entwicklung neuer Diagnostika. Mit den magnetischen Nachweis- und Quantifizierungskits von ImmunoStep können Exosomen effizient gemessen und durchflusszytometrisch quantifiziert werden. Die magnetischen Immunobead-Kits von ImmunoStep sind einfach in der Handhabung und erlauben eine zuverlässige Analyse von Exosomen aus menschlichen Körperflüssigkeiten und Zellkulturproben in der Durchflusszytometrie.

Whitepaper-Download Exosomen-Analyse

Anti-IDH1 R132H & mehr: IHC-Klassifizierung diffuser Gliome

Der IDH1 R132H Antikörperklon H09 ist unverzichtbar für die Gliomdiagnose und hat eine hohe Bedeutung für die Krebsforschung. Die hohe Zuverlässigkeit des IDH1 R132H Nachweises durch Klon H09 (DIA-H09) zeigt sich in 100 Publikationen auf CiteAb.

Der praktische Ansatz für die Diagnose von Astrozytomen und Oligodendrogliomen beginnt im Routinelabor mit der immunhistochemischen Untersuchung der IDH1 R132H und ATRX Expression. Die schrittweise Analyse molekularer Parameter mit einer IHC für IDH1 R132H und ATRX zu Beginn, gefolgt von einer 1p/19q Analyse mit anschliessender IDH-Sequenzierung führt abschliessend zu einem deutlich geringeren molekularen Testaufwand für die eindeutige Diagnose (Reus et al., Acta Nuropathol. 129, 2015).

Charakteristische Merkmale der 3 wichtigsten molekularen Gruppen adulter Gliome:

Diffuses Gliom mit IDH Mutation
und 1p/19q-Codeletion
Diffuses Gliom mit
IDH Mutation
Diffuses Glioma ohne
IDH Mutation
Biomarker
IDH1/2
1p/19q
ATRX
hTERT-Promotor
mutiert
Co-deletiert
nukleäre Expression
mutiert
mutiert
intakt
Verlust nukleäre Expression
Wildtyp
Wildtyp
intakt
nukleäre  Expression
mutiert
Typische histologische Erscheinung und Prognose
Histologie
WHO Grading
mediane Überlebenszeit
oligodendroglial
II oder III
>15 Jahre
astrozytisch
II oder III (IV)
8-12 Jahre
astrozytisch
IV (II oder III)
<2-3 Jahre

Die WHO-Klassifikation für ZNS Tumoren 2016 empfiehlt die Analyse neuer molekularer Marker an Formalin-fixierten Geweben und setzt dabei einen starken Fokus auf die immunhistochemische Bestimmung des IDH1 -, ATRX- und H3-K27M-Mutationsstatus.


Die IHC-Kombination von ATRX und IDH1 R132H reduziert den molekularen Testaufwand.

IDH1 R132H
Die 2016 CNS WHO Zertifikation empfiehlt IDH1 R132H IHC als Rückrat für die Differentialdiagnose von Gliomen. Eine positive IDH1 R132H IHC ist dabei ein günstiger prognostischer Marker.

ATRX
 ATRX Mutationen in Gliomen führen zu einem Verlust der nukleären Expression von ATRX (rechts), Die gleichzeitige 1p/19q Codeletion kann dabei in fast allen Fällen ausgeschlossen werden.


Die IHC von H3 K27M Mutationen defininiert Gliome der Mittellinie als eigenständige Entität.

Histon H3 K27M
Die WHO-Klassifikation 2016 beschreibt das diffuse Mittellinien-Gliom mit H3-K27M Mutation als neue Entität. Es kommt am häufigsten bei Kindern und Jugendlichen vor und ist in Mittellinienstrukturen lokalisiert.


p53 und Ki67 sind hilfreiche Zusatzmarker für die Einordnung diffuser Gliome.

Ki67
Hohe Ki-67 Expression ist dominant in IDH wildtyp Gliomen und eine geringe Ki-67 Expression wird mit IDH1 Mutationen in primären Gliomen assoziiert. Der mitotische Index ist signifikant mit dem Ausgang von IDH Wildtyp Tumoren korreliert.

p53
p53 kann als zusätzlicher Marker eingesetzt werden, da es Hinweise darauf gibt, dass es einen Zusammenhang zwischen der p53 Expression und der Deletion 1p/19q gibt, so dass eine Analyse auf genetischer Ebene nachrangig wäre.


Literatur:

Reuss DE et al. ATRX and IDH1-R132H immunohistochemistry with subsequent copy number analysis and IDH sequencing as a basis for an “integrated” diagnostic approach for adult astrocytoma, oligodendroglioma and glioblastoma. Acta Neuropathol. 129(1):133-146, 2015