Mehrfachmarkierung mit Sekundärantikörpern

Die Auswahl von Sekundärantikörpern zur simultanen Detektion von mehr als einem Antigen hängt von wenigstens zwei wichtigen Kriterien ab:

A) Verfügbarkeit von Sekundärantikörpern, die
1. von derselben Wirtsspezies stammen, so dass sie einander nicht erkennen,
2. keine anderen Primärantikörper im Versuchssystem erkennen,
3. keine Immunglobuline anderer Spezies erkennen, die möglicherweise im Versuchssystem präsent sind, und
4. nicht mit dem untersuchten Gewebe oder Zellmaterial kreuzreagieren

B) Verwendung von Labeln (Fluorochrome, Enzym-Reaktionsprodukte, elektronendichte Partikel), die optisch gut aufgelöst werden können.

Die mit MinX (Minimal Cross-Reactivity/Reaction) gekennzeichneten, affinitätsgereinigten Antikörper werden speziell hergestellt, um diese Kriterien zu erfüllen. Sie wurden mittels ELISA als nicht kreuzreaktiv getestet und sind gegen IgG und/oder Serumproteine anderer Spezies adsorbiert.
Ihre Kreuzreaktivität (X) mit Immunglobulinen dieser angegebenen Spezies ist „minimal“ (Min), d. h. unterhalb 1%.
(Ha = Armenischer Hamster, Hs = Syrischer Hamster, Ck = Huhn, Hu = Human, Rb = Kaninchen, Ms = Maus, Gp = Meerschweinchen, Ho = Pferd, Rt = Ratte, Bo = Rind, Sh = Schaf, Sw = Schwein, Go = Ziege)

Das folgende Schema zeigt ein Beispiel für den Einsatz solcher Kreuzreaktions-minimierten Antikörper in einer Mehrfachmarkierung. Die in Schritt 3 verwendeten Sekundärantikörper erkennen sich gegenseitig nicht, da sie alle aus Esel stammen. Durch die Festphasen-Präadsorption gegen Serumproteine der Primärantikörper-Spezies erkennen sie auch nicht die anderen Primärantikörper aus Schritt 2. Ebenso reagieren sie nicht mit den möglicherweise im Rattengewebe vorhandenen Ratte-Immunglobulinen und Serumproteinen. Jedoch geht die durch Ig/ Serumprotein-Adsorptionen gewonnene Erhöhung der Spezifität auf Kosten der Sensitivität: Esel-Sekundärantikörper, die gegen Serumproteine von bis zu zehn verschiedenen Spezies adsorbiert wurden, sind weniger affin als Ziege-Sekundärantikörper, die gegen Ig/ Serumproteine von drei bis fünf verschiedenen Spezies adsorbiert worden sind.

Hinweis: Antikörper, die gegen eine nahe verwandte Spezies adsorbiert wurden, weisen z. T. eine reduzierte Epitoperkennung auf und können monoklonale Antikörper mit seltenen IgG-Subklassen (IgG2b, IgG3), die weitestgehend homolog mit der Spezies sind, gegen die präadsorbiert wurde, nur eingeschränkt erkennen.

Dreifachmarkierung von Rattengewebe

Mehrfachmarkierung mit Sekundärantikörper

* Siehe auch: Beispiel Fab-Blocking von Gewebe

Hinweis: Der Nachweis von Antigen A, B und C kann parallel oder sukzessiv erfolgen. Im Parallelansatz werden die Antikörper in Schritt 2 (b, d, f) und 3 (c, e, g) in einem Cocktail aufgetragen, im Sukzessivansatz wird von a) bis g) jeweils in Einzelschritten nacheinander inkubiert. In beiden Vorgehensweisen wird zwischen den Antikörper-Inkubationen und nach der Blockierung (a) jeweils gründlich gewaschen. Bei starkem Hintergrund kann im Sukzessivansatz eine wiederholte Blockierung vor Schritt d) und f) erforderlich sein. Die Mehrfachmarkierung kann im Parallelverfahren durchgeführt werden, wenn das Färbe- und Hintergrundverhalten der Antikörper sich durch Mischung im Vergleich zu Einzelmarkierungen (Sukzessivfärbungen) nicht verändert. In Mischung können Antikörper (Immunglobuline) aufgrund spezifischer oder unspezifischer Wechselwirkungen miteinander reagieren und den Antigennachweis erschweren. Aus diesem Grund sollte dem Antikörperverdünnungspuffer außerdem kein Normalserum zugesetzt werden.

Weitere Tipps und Tricks:

Eine gute Übersicht über das Mehrfarben-Immunfluoreszenz-Labeling in der konfokalen Mikroskopie gibt der Beitrag von Brelje, Wessendorf und Sorenson, “Multi-color laser scanning confocal immunofluorescence microscopy: Practical application and limitations.” In Cell Biological Applications of Confocal Microscopy, B. Matsumoto. Orlando, FL: Academic Press, Inc. (Methods Cell. Biol. 1993, Vol. 38, 97; Methods Cell. Biol. 2002, Vol. 70, 165).

Beispielprotokoll: Vierfach-Immunfluoreszenzmarkierung im Parallelansatz

Vierfachmarkierung der Kalzium-bindenden Proteine Calbindin, Parvalbumin und Calretinin sowie perineuronaler Netze

(nach: Härtig et al. 1996, J. Neurosci. Methods 67: 89-95 und Schwaller et al. 1999, J. Neurosci. Methods 92: 137-144)

Mehrfachmarkierung_479_cff889bf65

Hippocampus der Ratte: A) Biotinyliertes Solanum tuberosum Agglutinin/Alexa Fluor 488-Streptavidin (Gefäße), B) Kaninchen-anti-GFAP/Cy3-Esel-anti-Kaninchen (Astroglia), C) Maus-anti-NeuN/AlexaFluor 647-Esel-anti-Maus (MinX Ratten IgG; neuronale Kerne), D) “Merge” (W. Härtig, Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Germany)

Die Cytochemie Kalzium-bindender Proteine ist oft eine Methode der Wahl zur Darstellung morphologischer Details immunpositiver Nervenzellen. Eine Mehrfachmarkierung dieser Marker tragen zur Aufklärung von komplizierten Struktur-Funktions-Beziehungen im Zentralnervensystem bei.

Material: 30 µm-dicke, frei bewegliche Gefrierschnitte von Paraformaldehyd-fixiertem Rattenhirn.*
Hinweis: Die Schnitte werden frei flottierend in Vertiefungen von Mehr-Well-Platten gefärbt/gewaschen und erst nach der Färbung auf Objektträger aufgezogen. Das Transferieren der Schnitte in einzelne Wells erfolgt mit Hilfe eines geeigneten Pinsels.

Alle Schritte bei Raumtemperatur durchführen:

1. 3 x 10 min Waschen des Gewebes mit 0,1 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,4

2. Blocken unspezifischer Bindungsstellen des Gewebes mit 5% Esel-Normalserum (Kat.-Nr. 017-000-121) in TBS + 0,3% Triton X-100 (= ENS-TBS-T); 1 h

3. Inkubation mit einem Cocktail primärer Antikörper und Wisteria floribunda Agglutinin in ENS-TBS-T; 16 h* bei Raumtemperatur:
• Maus-anti-Calbindin [1:200; Klon CL-300; Sigma]
• Kaninchen-anti-Parvalbumin [1:500; Swant]
• Ziege-anti-Calretinin [1:100; Swant]
• Biotinyliertes, reduziertes Wisteria floribunda Agglutinin (20 µg/ml; Sigma)

4. 3 x 10 min Waschen der Schnitte mit TBS

5. Inkubation mit einem Cocktail sekundärer fluorochromierter Antikörper, verdünnt mit TBS (+ 2% Rinderserumalbumin, z.B. Fraktion V)]; 1 h:
• Alexa Fluor 488-Esel-anti-Maus IgG (Kat.-Nr.: 715-545-151; 20 µg/ml)
• Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (711-165-152; 20 µg/ml)
• AMCA-Esel-anti-Ziege IgG (705-155-147; 30 µg/ml)
• Alexa Fluor 647-Streptavidin (016-600-084; 20 µg/ml)

6. 3 x 10 min Waschen der Schnitte mit TBS und mit destilliertem Wasser (1 min)

7. Aufziehen der Schnitte auf fluoreszenzfreie Objektträger; Lufttrocknung

8. Eindecken z.B. mit Entellan (in Toluen; Merck) oder mit einem wässrigen Eindeckmedium.


* Bitte beachten Sie: Dies ist kein Standardprotokoll. Die Inkubationszeit für die Primärantikörper ist abhängig von den Antikörpereigenschaften und der Dicke der Gewebeschnitte. Sie kann von 1 h bis mehreren Stunden bei Raumtemperatur bis zu einigen Tagen bei 4°C variieren.


Immunfluoreszenznachweis-Methoden lassen sich auch an Paraffin- und Kryostatschnitten sowie an Wholemounts durchführen, vorausgesetzt es stehen geeignete Primärantikörper zur Verfügung. Zur empfindlichen Darstellung bestimmter, oft Membran-assoziierter Antigene behandelt man die Gewebe während der histochemischen Verfahren mit Detergenzien (häufig verwendet: 0,1-1% Triton X-100, das oft der Blockierlösung für die Primärantikörper zugefügt wird). Weil Triton irreversibel wirkt, reicht sein einmaliger Einsatz während der Versuche und es kann auf seinen Zusatz zu Sekundärantikörpern verzichtet werden. Durch höhere Tritonanteile in Inkubationslösungen, die für verschiedenene immunhistochemische Verfahren eingesetzt werden, können Artefakte wie z.B. Myelinfärbungen auftreten (siehe Weruaga et al. 1998).

anti-Hapten Konjugate für FISH

Western Blot – Anti-IgG, Fc spezifische MinX-Sekundärantikörper

Western Blot – Anti-(Sub-)Klassen-spezifische MinX-Sekundärantikörper

Anti-IgG/M (H+L) ohne Spezies-Kreuzreaktion (MinX) für den Western Blot

Affinitätsgereinigte monovalente Fab-Fragmente

Fab-Fragment

Fab-Fragmente eignen sich dazu, die Oberfläche von Immunglobulinen sterisch zu blockieren. Dies macht es möglich, Primärantikörper aus derselben Spezies in einer Doppelfärbung zu detektieren oder um zell- oder gewebeeigene Immunglobuline zu blockieren, um so Hintergrundfärbung zu reduzieren.
Monovalente Fab-Fragmente besitzen nur eine Bindungsstelle für Antigene. Im Gegensatz dazu verfügen komplette IgG-Moleküle und IgG F(ab’)2-Fragmente über zwei Bindungsstellen für Antigene.
Nur diese Eigenschaft der monovalenten Fab-Fragmente macht die  Anwendung für die oben genannten Zwecke möglich, da IgG-Gesamtmoleküle und F(ab’)2-Fragmente einen zweiten Primärantikörper aus derselben Spezies binden können und zu einer ungewollten Doppelmarkierung führen!
Fab-Fragmente sind nicht gegen Serumproteine anderer Spezies  präadsorbiert.
Zell- oder gewebeeigene Immunglobuline (z.B. in Mausgewebe) können durch 30–60 min Inkubation des Gewebes mit
10–100 µg/ml unkonjugiertem Fab-Fragment (z.B. Ziege anti-Maus IgG) blockiert werden.

Eine Übersicht aller erhältlichen konjugierten und unkonjugierten Fab-Fragmente erhalten Sie in der Produktauswahl Sekundärantikörper bei gewählter IgG-Form: IgG, Fab-Fragment.

Anti-Hapten Konjugate in immunhistologischen Färbungen

Anti-Hapten-Systeme können sehr gut in Mehrfachmarkierungen mit haptenylierten Primärantikörpern eingesetzt werden (Abb. 1). Besonders dann, wenn sich Primärantikörper nicht mit Spezies- oder Subklassen-spezifischen Sekundärantikörper-Konjugaten unterscheiden lassen, garantieren sie eine empfindliche und differenzierte Darstellung der Antigene.

Fluorescein-anti-Fluorescein-Markierungen

Anti-Fluorescein Antikörper bilden neben ihrer besonderen Eignung für Mehrfachmarkierungen eine hervorragende Grundlage für die nachfolgende Signalverstärkung durch Markerenzyme, Fluoreszenz- und Immungold-Markierungen. Ein wesentlicher Vorteil von Fluorescein-anti-Fluorescein Techniken gegenüber anderen Hapten-anti-Hapten-Verfahren sowie (Strept)Avidin-Methoden besteht darin, dass Hapten-Signale detektiert werden können oder ihre Konzentration durch Absorption in Lösung messbar ist, bevor der sekundäre Nachweisschritt folgt. Außerdem kann durch ein auf Fluorescein-anti-Fluorescein basiertes Nachweissystem unerwünschte Hintergrundfärbung zelleigenen Biotins umgangen werden.

Abbildung 1
Abbildung 1

Peroxidase-markierte Antikörper gegen Fluorescein erlauben die Umwandlung des Fluoreszenz-Signals Fluorescein-konjugierter Nachweisreagenzien in ein lichtmikroskopisch sichtbares und elektronendichtes Reaktionsprodukt (Abb. 2). Der Einsatz dieser Konjugate steigert die Nachweisempfindlichkeit erheblich, erfordert aber auch eine sorgfältige Optimierung der Konzentration von Fluorescein-konjugierten Markern. So reicht bereits ein Zehntel der für die Durchflusszytometrie angegebenen Einsatzkonzentration eines Fluorescein-konjugierten CD-Markers, um in einer immunhistochemischen Färbung mit Peroxidase-konjugiertem anti-Fluorescein Antikörper ein deutliches Signal zu erhalten (Abb. 2). Konjugate aus Markerenzymen und anti-Fluorescein Antikörper lassen sich außerdem in ELISAs oder zum Nachweis Fluorescein-markierter Proben auf Blot-Membranen einsetzen.

Abbildung 2 (1* und 2*)
Abbildung 2 (1* und 2*)

Abb. 2: Konvertierung von Fluoreszenz in ein lichtmikroskopisch sichtbares Reaktionsprodukt.(A) Mikroglia in autoptischem corticalen Hirngewebe. Umwandlung der relativ schwachen Fluoreszenz-Markierung mit Fluorescein anti-CD45 durch Peroxidase-markierten anti-Fluorescein Antikörper (#200-032-037) und das Chromogen Nickel-verstärktes Diaminobenzidin (DAB). (B) Perineuronale Netze der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Konversion grünfluoreszierender Lektin-Bindungsstellen für Fluorescein-markiertes Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) durch Peroxidase-konjugierten anti-Fluorescein Antikörper (# 200-032-037) und Nickel-verstärktes DAB.

Abbildung 3
Abbildung 3

Mit Alexa Fluor 488 oder anderen Grünfarbstoffen markierte anti-Fluorescein Antikörper eignen sich dazu, die Grünfluoreszenz des an einen Antikörper, eine Nukleinsäure oder anderen Biomoleküls gekoppelten Haptens Fluorescein zu verstärken, ohne dessen Fluoreszenzfarbe zu ändern (Abb. 3). Fluorescein-gekoppelte Marker sind bei nachträglicher Amplifizierung in einer höheren Verdünnung einsetzbar als ohne Signalverstärkung. Darüber hinaus ist die Alexa Fluor 488-Fluoreszenz weniger empfindlich gegenüber Fading als die des Fluoresceins.

Abb. 3: Verstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein. Perineurales Netz der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Farbverstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein-konjugiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) mit grün-markiertem anti-Fluorescein Antikörper (z.B. #200-542-037).

Abbildung 4
Abbildung 4

Mit leuchtenden Rotfarbstoffen wie Cy3 markiertes anti-Fluorescein kann genutzt werden, um die Grünfluoreszenz eines Fluorescein-Konjugates in eine photostabile Rot-Fluoreszenz umzuwandeln und dadurch das Signal von Fluorescein-Konjugaten zu verstärken (Abb. 4).

Abb. 4: Umwandlung der Grünfluoreszenz in ein stabil rot fluoreszierendes Signal. Doppelmarkierung eines perineuronalen Netzes der extrazellulären Matrix (rot) und Blutgefäßen (blau) im Ratten-Neocortex. Netzdarstellung mit Fluorescein-markiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) gefolgt von Cy3-markiertem anti-Fluorescein Antikörper. Gefäßmarkierung mit biotinyliertem Kartoffel-Lektin (Solanum tuberosum Agglutinin) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084).

Abbildung 5
Abbildung 5

Gemeinsam mit anti-Digoxin oder anti-Biotin (oder Streptavidin) können anti-Fluorescein-Konjugate für Doppel- und Mehrfachfärbungen mit Hapten-konjugierten Markern eingesetzt werden (Abb. 5). Peroxidase-Konjugate von Antikörpern gegen Haptene ermöglichen in CARD-Nachweissystemen im Zusammenspiel mit Fluoreszenz-markierten Tyramid-Derivaten eine erheblich verbesserte Nachweisempfindlichkeit.

Abb. 5: Hapten-anti-Hapten-Mehrfach-Markierung. Dreifachmarkierung von Gefäßen, perineuronalen Netzen der extrazellulären Matrix und Astroglia im Cortex der Ratte. Die Färbung der Blutgefäße (blau) erfolgte mit biotinyliertem Lektin (Solanum tuberosum) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084). Perineuronale Netze (grün) wurden mit Fluorescein-markiertem Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) und nachfolgend grün-markiertem anti-Fluorescein (z.B. # 200-542-156) dargestellt, während digoxigenyliertes anti-GFAP und Cy3-konjugiertes anti-Digoxin (200-162-156) der Detektion von Astroglia diente.

* Literatur – Anwendungsbeispiele

Abbildungsnachweis: (*1) Alle abgebildeten Präparate stammen von Wolfgang Härtig aus dem Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung (PFI) der Universität Leipzig. Die Abbildungen von Fluoreszenzmarkierungen wurden an einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM) 510 Meta von Jens Grosche (PFI) angefertigt. (*2) Die Aufnahmen der Immunperoxidase-Markierungen erfolgten durch Uli Gärtner (PFI) an einem Axiophot, ausgestattet mit einer AxioCam HRC sowie dem Programm AxioVision 3.1.2.1.

Verdünnung von Sekundärantikörpern

Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch werden mit der höchsten Verdünnung in Immunoassays eingesetzt. Unsere Empfehlungen für den erfolgreichen Einsatz in ELISA, Western Blot, Histo- / Cytochemie und Durchflusszytometrie (FACS) haben wir in folgenden Übersicht zusammengestellt. Da die optimale Verdünnung von unterschiedlichen Faktoren abhängen kann, sollte jeder Anwender die richtige Gebrauchsverdünnung für sein Experiment empirisch bestimmen.

Sekundärantikörper

ProduktKonjugatELISAWestern BlotHisto- / CytochemieDurchflusszytometrie
Gesamt IgG und F(ab’)2Unkonjugiert10 – 20 µg/ml10 – 20 µg/ml10 – 20 µg/ml10 – 20 µg/ml
FabUnkonjugiert20 – 40 µg/ml20 – 40 µg/ml20 – 40 µg/ml20 – 40 µg/ml
Gesamt IgG, F(ab’)2 und FabAlexa Fluor 488, 594, 647 und Cy31:100 – 1:8001:100 – 1:800
Gesamt IgGAlexa Fluor 680 und 7901:50.000 – 1:200.000
Gesamt IgGBV421 und BV4801:50 – 1:2001:50 – 1:200
Gesamt IgG, F(ab’)2 und FabAMCA, Cy2, FITC, TRITC, RRX1:50 – 1:2001:50 – 1:200
Gesamt IgGCy51:100 – 1:4001:100 – 1:400
Gesamt IgG und F(ab’)2R-PE und APC1:50 – 1:200
Gesamt IgG und F(ab’)2PerCP1:25 – 1:100
Gesamt IgG und F(ab’)2Horseradish Peroxidase (HRP)1:5.000 – 1:100.0001:5.000 – 1:100.000 ; 1:10.000 – 1:200.000 (ECL)1:200 – 1:5.000
Gesamt IgG und F(ab’)2Alkalische Phosphatase1:5.000 – 1:50.0001:5.000 – 1:50.000
Gesamt IgG, F(ab’)2 und FabBiotin (mit Fluorophor-konjugierten Streptavidin)1:200 – 1:1.0001:200 – 1:1.000
Gesamt IgG und F(ab’)2Biotin (mit Enzym-konjugierten Streptavidin)1:20.000 – 1:40.0001:20.000 – 1:40.0001:500 – 1:5.0001:200 – 1:1.000

Streptavidin

ProduktKonjugatELISAWestern BlotHisto- / CytochemieDurchflusszytometrie
StreptavidinR-PE und APC1:50 – 1:200
StreptavidinPerCP1:25 – 1:100
StreptavidinHorseradish Peroxidase (HRP)1 – 2 µg/ml1 – 2 µg/ml ; 0,01 – 1 µg/ml (ECL)1 – 2 µg/ml
StreptavidinAlkalische Phosphatase1 – 2 µg/ml1 – 2 µg/ml ; 0,1 – 1 µg/ml (ECL)1 – 2 µg/ml
StreptavidinAlle Alexa Fluor, DyLight 405 und Cy30,5 – 2 µg/ml0,5 – 2 µg/ml
StreptavidinCy51 – 4 µg/ml1 – 4 µg/ml
StreptavidinAlle weiteren Fluorophore2 – 5 µg/ml2 – 5 µg/ml

Weitere Produkte

ProduktELISAWestern BlotHisto- / CytochemieDurchflusszytometrie
4nm Colloidal Gold-Antikörper Komplex1:20 – 1:200
6nm, 12 Colloidal Gold-Antikörper Komplex1:20 – 1:40
18nm Colloidal Gold-Antikörper Komplex1:10 – 1:20
Peroxidase-Anti-Peroxidase (PAP)1:5.000 – 1:50.0001:5.000 – 1:50.00025 – 50 µg/ml, 1:400 – 1:800
ChromPure10 µg/ml

Serum

Für die Blockierung von Hintergrundsignalen mit Normalseren empfehlen wir 5% v/v.

Anti-Kamelid Sekundärantikörper

Einzeldomänenantikörper aus Kameliden finden zunehmend Verwendung in immunologischen Methoden der Analytik, Diagnostik und Forschung. Um den steigenden Bedarf und damit die Produktion von VHH-Antikörpern zu unterstützen, bietet der amerikanische Hersteller Jackson ImmunoResearch drei neue Sekundärantikörper für die spezifische Detektion und Quantifikation von Kameliden-Immunglobulinen an. Diese Gesamt-IgG sowie IgG2 und IgG3 spezifischen Antikörper erlauben eine genaue Unterscheidung von IgG-Subklassen in kameliden Serum und ermöglichen damit eine optimierte Herstellung von Nanobodies aus Schwere-Ketten-Antikörpern.

Im Serum von Kameliden (Alpakas, Lamas, Kamele, Dromedare, Vikunjas und Guanakos) finden sich drei IgG-Subklassen (IgG1, IgG2 und IgG3). Erfahren Sie hier mehr über die Struktur der Subklassen.

Detektion von kameliden IgG-Subklassen im Western Blot

Anti-Alpaka IgG (H+L) und Anti-Alpaka IgG2+IgG3 von Jackson ImmunoResearch eignen sich für die Identifizierung von Alpaka IgG und Lama IgG. Abbildung 1 und 2 zeigen den spezifischen Nachweis von Alpaka und Lama IgG-Subklassen im Westen Blot.

IgG-Subklassen wurden aus Serum isoliert (Protokoll nach Mass et al., 2007) und durch SDS-Page unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die Immunglobuline wurden anschließend auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern markiert (Verdünnung: 1: 20.000). Proteine wurden mit Chemilumineszenz Substrat nachgewiesen.

Alpaka IgG-Subklassen im Western Blot
Abbildung 1: Nachweis von Alpaka IgG-Subklassen im Western Blot. Folgende Sekundärantikörper wurden verwendet:
Blot A, Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L)-HRPO 128-035-003; Blot B, Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L)-HRPO [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] 128-035-160; Blot C, Ziege IgG anti-Alpaka IgG2+IgG3-HRPO [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] 128-035-229.
Lama IgG-Subklassen im Western Blot
Abbildung 2: Nachweis von Lama IgG-Subklassen im Western Blot. Folgende Sekundärantikörper wurden verwendet:
Blot D, Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L)-HRPO 128-035-003; Blot E, Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L)-HRPO [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] 128-035-160; Blot F, Ziege IgG anti-Alpaka IgG2+IgG3-HRPO [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] 128-035-229.

Zeitpunkt der Immunantwort optimal bestimmen

Für die Entwicklung von rekombinanten Nanobodies* werden Alpakas oder Lamas zunächst mit einem Antigen immunisiert. Eine anschließende Überwachung der Immunantwort ist nötig, um den idealen Zeitpunkt für die PBMC-isolation zu bestimmen.

Anti-Alpaka Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch ermöglichen Gesamt-IgG von Schwere-Ketten Antikörpern im Kameliden Serum zu unterscheiden. Da während einer Immunisierung die Antikörperantwort von IgG1, IgG2 und IgG3 nicht immer zeitgleich erfolgt, wird somit die Ausbeute an Schwere-Ketten-Antikörpern produzierenden PBMCs optimiert.

Die Serokonversion (Antigenspezifische Antikörper-Titer) kann mittels ELISA oder Durchflusszytometrie/ FACS (Pardon et al., 2014) bestimmt werden. Mit Jackson Anti-Alpaka IgG (H+L) Sekundärantikörpern kann die prä-Immun und post-Immun Phase der Serokonversion überwacht werden. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kann die Generierung von Schwere-Kette Antikörpern jedoch nicht eindeutig mit Gesamt-IgG Antikörpern bestimmt werden. Jackson Anti-Alpaka IgG2+IgG3 sind ideal für die Messung von Schwere-Ketten Antikörper im Serum. Hiermit kann der optimale Zeitpunkt für die PBMC-Isolation bestimmt und dadurch die Ausbeute an potentiellen Antikörpern für die VHH-Bibliothek erhöht werden.

Nach der Immunisierung mit einem Antigen wurden ELISAs für die Charakterisierung der spezifischen Antikörperreaktion verwendet. ELISA Platten wurden hierfür mit dem Zielantigen gecoated, Antiserum diente als primäre Antikörperquelle und Peroxidase-konjugierte Sekundärantikörper 128-035-160 oder 128-035-229 wurden jeweils zur Bestimmung von Gesamt-IgG oder der IgG2- und IgG3-Subklassen verwendet.

Alpaka Immunisierung
Abbildung 3a: Antikörper 128-035-160 und 128-035-229 wurden für die Messung des antigenspezifischen Antikörper-Titer in Alpaka Serum während eines repräsentativen Immunisierung/ Booster Protokolls verwendet.

Prozentualer Vergleich zwischen IgG2 und IgG3 zu Gesamt IgG mittels ELISA
Abbildung 3b: Prozentsatz von IgG2 und IgG3 im Vergleich zu Gesamt-IgG im Serum. Analyse im ELISA.

Der Gesamt-IgG-Titer deutet auf einen idealen Isolierungszeitpunkt 150 Tagen nach Immunisierung, zu diesem Zeitpunkt ist die IgG2 und IgG3 Reaktion aber noch relativ schwach, erst 300 Tage nach Immunisierung ist der Titer optimal für eine PBMC-Isolation.

Wir haben 3 neue Spezifitäten in unserem Sortiment!

Anti-Alpaka IgG (H+L)

wdt_IDSekundärantikörperArt.-Nr.
1Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L) **128-005-003
2Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L) [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] **128-005-160

Anti-Alpaka IgG2 + IgG3

Dieser Antikörper erkennt Alpaka und Lama IgG2- und IgG3-Subklassen in Serum und PBMCs, ohne Kreuzreaktion mit IgG1.

wdt_IDSekundärantikörperArt.-Nr.
1Ziege IgG anti-Alpaka IgG2+IgG3 [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] **128-005-229

** Bitte beachten, diese Antikörper reagieren hauptsächlich mit der Fc Region. Sie sollten nicht für den Nachweis von VHH-Antikörpern eingesetzt werden. Hier finden Sie VHH-spezifische Antikörper und weitere Informationen.

Sekundärantikörper gegen Alpaka IgGs sind mit folgenden Konjugaten erhältlich:

• Unkonjugiert
• Horseradish Peroxidase
• Alkaline Phosphatase
• Biotin
• DyLight™ 405
• Alexa Fluor® 488
• Fluorescein (FITC)
• Cy™ 3
• R-Phycoerythrin
• Alexa Fluor® 594
• Rhodamine Red-X™
• Alexa Fluor® 647
• Cy™ 5

Literatur:

Für weitere Informationen über Antikörper aus Kameliden:

  • Arbabi-Ghahroudi, M. (2017). Camelid Single-Domain Antibodies: Historical Perspective and Future Outlook. Front. Immunol. 8, 1-8.
  • Daley, L.P., Gagliardo, L.F., Duffy, M.S., Smith, M.C., and Appleton, J.A. (2005). Application of Monoclonal Antibodies in Functional and Comparative Investigations of Heavy-Chain Immunoglobulins in New World Camelids. Clin. Diagn. Lab Immun. 12, 380-386.
  • Maass, D.R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., and Shoemaker, C.B. (2007). Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). J. Immunol. 324, 13–25.
  • Pardon, E., Laeremans, T., Triest, S., Rasmussen, S.G.F., Wohlkönig, A., Ruf, A., Muyldermans, S., Hol, W.G.J., Kobilka, B.K., and Steyaert, J. (2014). A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nat. Protoc. 9, 674-693.
  • Wagner, H.J., Sehrle, S. Weiss, E. Cavallari, M., and Weber, W. (2018). A Two-Step Approach for the Design and Generation of Nanobodies. Int. J. Mol. Sci. 19, 1-16.

AffiniPure™ Antibodies is trademark of Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.
*Nanobody is a registered trademark of Ablynx N.V
DyLight™ fluorescent dyes is a trademark of Thermo Fisher Scientific.
Cy™ is a registered trademark of GE Healthcare.
Rhodamine Red™-X is a trademark of Invitrogen.
Alexa Fluor® is a trademark of Life Technologies Corp.
Images property Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.

Verbessertes Nanobody Screening mit Anti-VHH Sekundärantikörpern

Einzeldomänenantikörper, die auch als Nanobodies* oder Nanoantikörper bezeichnet werden, gewinnen aufgrund ihrer besonderen biologischen Eigenschaften immer mehr an Bedeutung. Anti-Alpaka IgG-Subklassen und VHH-Domäne (variable domain heavy chain-only antibodies) spezifische Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch helfen bei der Optimierung der VHH-Antikörper / Einzeldomänenantikörper / Nanobody* Entwicklung und erlauben einen effektiveren Nachweis dieser Antikörperklassen.

VHH-Antikörper

Alpakas und Lamas produzieren neben konventionellen Immunglobulinen, Antikörper mit einzigartigen Eigenschaften. Seit der ersten erfolgreichen Isolation von kameliden Schwere-Ketten-Antikörpern, konzentrieren sich Wissenschaftler auf die relativ kleine (12-15 kDa), aber hochspezifische VHH-Domäne. Diese dient als neues Modell für die Produktion rekombinanter Antikörper (Nanobodies*). VHH-Antikörper können die Blut-Hirn-Schranke überwinden, erlauben eine sehr gute Gewebepenetration sowie die Detektion von Antigenen im Zytosol, zudem binden sie mit einer hoher Stabilität über ihre lange CDR3-Schleife.

VHH-Antikörper lassen sich leicht klonieren und mittels rekombinanter Systeme in hohen Mengen produzieren. Sie besitzen eine große pH-Stabilität und Löslichkeit. Aufgrund dieser Eigenschaften finden sich für die Einzeldomänenantikörper viele Anwendungsmöglichkeiten. Die Immunglobuline werden in diagnostischen Kits zur Detektion kleiner Moleküle, als Biosensoren und in verschiedenen medizinischen Applikation, beispielsweise zur Krebsbehandlung, erfolgreich eingesetzt.

Generierung von kameliden VHH-Antikörperbibliotheken

Entwicklung rekombinanter VHH-Antikörper

VHH-Antikörper werden anhand eines etablierten Protokolls (siehe Abbildung) produziert. Anti-Alpaka Antikörper von Jackson können in verschiedenen Produktionsschritten eingesetzt werden, wodurch die Entwicklung von VHH-Antikörpern verbessert und beschleunigt wird.

Idealen Zeitpunkt für die PBMC-Isolation bestimmen

Alpaka Immunisierung

Anti-Alpaka IgG und Subklassenspezifische IgG2 und IgG3 Antikörper ermöglichen den richtigen Zeitpunkt für die Isolation von VHH-produzierenden PMBC zu bestimmen. Die VHH-Domäne findet sich nur auf den Schwere-Ketten-Antikörpern, daher kann eine Überwachung, die nur auf den Daten des Gesamt-IgG Titer beruht, zu einer schwachen Ausbeute an VHH-produzierenden Lymphozyten führen.

Erfahren Sie hier mehr über die Möglichkeiten einer Optimierung mit subklassenspezifischen IgG2 und IgG3 Antikörpern.

Verbesserte Detektion von VHH-Antikörpern mit Ziege Anti-Alpaka IgG (VHH-Domäne)

Anti-VHH Sekundärantikörper im Western Blot.

Anti-Alpaka IgG (VHH-Domäne) Antikörper zeigen ein stärkeres Signal im Western Blot als anti-Tag Antikörper.

Da polyklonale Antikörper ein breites Spektrum an Epitopen erkennen, binden im Gegensatz zu Antikörpern die nur an einen kleinen Teil einer Peptidsequenz erkennen, mehr Signalmoleküle (z.B. Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme) an einer einzelnen VHH-Domäne. In dieser Abbildung wird ein His6 getaggtes rekombinantes VHH im Western Blot jeweils mit Ziege IgG anti-Alpaka IgG (VHH) und anti-His6 Antikörper detektiert.

Aussagekräftige Validierung der VHH-Expression und Bindungsaktivität

Test auf VHH-Expression im ELISA

Signifikante Signale können jetzt bereits bei einer geringen VHH Konzentration erreicht werden.

Die Kontrolle von VHH-exprimierenden Klonen auf Löslichkeit und Bindungsaktivität erfolgt vorzugsweise im ELISA. In dieser Abbildung wurde VHH entlang des gecoaten Immunogens titriert und mittels anti-Alpaka IgG (VHH)-HRPO detektiert.

Anti-Alpaka IgG Sekundärantikörper

SekundärantikörperArt.-Nr.
Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L) **128-005-003
Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L) [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] **128-005-160
Ziege IgG anti-Alpaka IgG2+IgG3 [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] **128-005-229
Ziege IgG anti-Alpaka IgG (VHH) [MinX Bo]128-005-232
Ziege IgG anti-Alpaka IgG (VHH) [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt]128-005-230

Anti-Alpaka IgG Antikörper von Jackson ImmunoResearch erkennen spezifisch Alpaka und Lama IgG (H+L), IgG2- und IgG3-Subklassen, oder die VHH-Domäne.

** Bitte beachten, diese Antikörper reagieren hauptsächlich mit der Fc Region. Sie sollten nicht für den Nachweis von VHH-Antikörpern eingesetzt werden.

Sekundärantikörper gegen Alpaka IgGs sind mit folgenden Konjugaten erhältlich:

• Unkonjugiert
• Horseradish Peroxidase
• Alkaline Phosphatase
• Biotin
• DyLight™ 405
• Alexa Fluor® 488
• Fluorescein (FITC)
• Cy™ 3
• R-Phycoerythrin
• Alexa Fluor® 594
• Rhodamine Red-X™
• Alexa Fluor® 647
• Cy™ 5

AffiniPure™ Antibodies is trademark of Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.
*Nanobody and Nanobodies are registered trademarks of Ablynx N.V
DyLight™ fluorescent dyes is a trademark of Thermo Fisher Scientific.
Cy™ is a registered trademark of GE Healthcare.
Rhodamine Red™-X is a trademark of Invitrogen.
Alexa Fluor® is a trademark of Life Technologies Corp.
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