Fluoreszenzfarbstoffe für Sekundärantikörper

Fluorophore, gekoppelt an Antikörper oder Streptavidin, ermöglichen eine einfache und schnelle Visualisierung von Analyten. Es gibt eine Vielzahl an Fluoreszenzfarbstoffen mit jeweils spezifischen Eigenschaften. Erfahren Sie in diesem FAQ mehr über Jackson ImmunoResearch Sekundärantikörperkonjugate, die in allen gängigen Immunoassays (u.a. Durchflusszytometrie, Mikroskopie, Western Blot und ELISA) eingesetzt werden können. Die Wahl des “richtigen” Fluoreszenzfarbstoffs hängt von verschiedenen Faktoren ab, hier erhalten Sie weitere Tipps. Die hier aufgeführte alphabetische Liste der Fluorophore führt dabei nur die Farbstoffe auf, die von uns oder unseren Partnern zur Herstellung von Antikörper-Konjugaten verwendet werden und erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit.

Alexa Fluor®-Farbstoffe

Alexa Fluor®-Farbstoffe ergeben Konjugate mit einer hohen, den meisten herkömmlichen Fluoreszenzfarbstoffen überlegenen Leuchtkraft und Fotostabilität. Durch das hohe Absorptionsvermögen im Wellenlängenbereich gängiger Anregungsquellen und einer geringen Tendenz zur Fluoreszenzlöschung (‘quenching’) nach Kopplung an Proteine, produzieren Biokonjugate von Alexa Fluor Farbstoffen eine außergewöhnlich helle und stabile Fluoreszenz. Die Fluoreszenzintensität ist zudem unempfindlich gegenüber Schwankungen des pH-Wertes (pH 4 – 10). Eine gute Wasserlöslichkeit der Farbstoffe macht die Konjugate widerstandsfähig gegen Aggregation und Präzipitation, was gängige Probleme mit Hintergrundfärbung verhindert. Alexa Fluor-Farbstoffe sind aufgrund struktureller Ähnlichkeiten mit den DyLight-Farbstoffen eng verwandt.

Alexa Fluor® 488

Alexa Fluor 488 (Amax 493 nm, Emax 519 nm) besitzt mit Fluorescein (FITC) vergleichbare Spektraleigenschaften hinsichtlich Anregung und Emission, produziert jedoch Konjugate, die weit fluoreszenzintensiver, fotostabiler und unempfindlicher gegenüber pH-Schwankungen zwischen pH 4 und 10 sind. Alexa Fluor 488-Konjugate sind mit für Fluorescein üblichen Geräteausstattungen, Einstellungen oder Filtern kompatibel und eignen sich ideal für alle fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Anwendungen mit höchsten Sensitivitäts-Ansprüchen. Alexa Fluor 488 kann im Epifluoreszenzmikroskop länger sichtbar gemacht werden und heller erscheinen als Fluorescein, auch ohne die Zugabe von Anti-Fading Reagenzien in wässrige Eindeckmittel. Auch in dauerhaften organischen Eindeckmitteln ist Alexa Fluor 488 leuchtstärker und langzeitstabiler als Fluorescein. Alexa Fluor 488 ist vergleichbar mit DyLight 488.

Alexa488-Konjugat

Alexa Fluor® 594

Alexa Fluor 594-Konjugate (Amax 591 nm, Emax 614 nm) fluoreszieren im roten Bereich des Lichtspektrums, sind leuchtintensiver als andere rot fluoreszierenden Farbstoff-Konjugate und liefern eine deutlich bessere Farbtrennung von grünen Fluoreszenzfarbstoffen als Cy3 oder TRITC. Daher sind sie die beste Wahl für Immunfluoreszenz-Nachweise im dunkleren Rotbereich des sichtbaren Spektrums. Alexa Fluor 594-Konjugate fluoreszieren wesentlich stärker und stabiler als Texas Red-Konjugate, sind besser wasserlöslich und verursachen weniger Hintergrundfärbung. Die Fotostabilität ist jedoch auch vom Eindeckmedium abhängig: während Alexa Fluor 594-Konjugate in ProLong® Gold Antifade (Life Technologies) stabiler als Texas Red-Konjugate sind, bleichen sie in VECTASHIELD® (Vector Laboratories) schneller aus.

Alexa594-Konjugat

Alexa Fluor® 647

Alexa Fluor 647-Konjugate (Amax 651 nm, Emax 667 nm) entsprechen in ihren Spektraleigenschaften nahezu denen von Cy5-Konjugaten, sind jedoch wesentlich heller als diese. Wenn im nahen Infrarot-Bereich fluoreszierende Sekundärantikörper eingesetzt werden sollen, sind Alexa Fluor 647-Konjugate die beste Wahl für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und eine vergleichbare oder sogar bessere Alternative zu APC-Konjugaten für die Durchflusszytometrie. Alexa Fluor 647-Konjugate können aufgrund des weiten Abstands ihrer Emission von anderen, bei kürzeren Wellenlängen emittierenden Fluorochromen mit vielen anderen Fluoreszenzfarbstoffen kombiniert und hervorragend für Mehrfachmarkierungen in der konfokalen Lasermikroskopie eingesetzt werden. Ein besonderer Vorteil von Alexa Fluor 647 gegenüber anderen Fluoreszenzfarbstoffen ist die bei Anregung mit rotem Licht resultierende niedrige Autofluoreszenz biologischer Proben. Da die Fluoreszenz bei 670 nm vom menschlichen Auge nicht ausreichend wahrgenommen werden kann, kann Alexa Fluor 647 mit einem konventionellen Epifluoreszenzmikroskop nicht optimal bzw. kaum sichtbar gemacht werden, zumal die Quecksilberlampe, die in den meisten Geräten verwendet wird, nicht genügend Licht innerhalb des Anregungsbereiches von Alexa Fluor 647 emittiert. Alexa Fluor 647-Konjugate werden daher nicht für die Verwendung in der Epifluoreszenzmikroskopie empfohlen. Sie werden meist durch mit einem geeigneten Anregungs-Laser (Helium-Neon-Laser (bei 633 nm), Krypton-Ionen-Laser (bei 647 nm), Diodenlaser) und Infrarot-Detektor sichtbar gemacht. Für die Durchflusszytometrie stellen Alexa Fluor 647-Konjugate eine günstige und in ihrer Fluoreszenzintensität vergleichbare bis bessere Alternative zu APC-Konjugaten dar. Durch die geringere Molekülgröße von Alexa Fluor 647 (1,3 kDa) im Vergleich zu APC (104 kDa), sind die resultierenden Antikörper-Konjugate von Alexa Fluor 647 außerdem wesentlich kleiner und besser für intrazelluläre Markierungen in der Durchflusszytometrie geeignet.

Alexa Fluor 647-Konjugat

AMCA (Aminomethylcoumarin-Acetat)

AMCA-Konjugate werden aufgrund ihrer spektralen Eigenschaften (Amax 350 nm, Emax 450 nm) zumeist überwiegend für Mehrfachmarkierungen sowohl in der Immunfluoreszenz-Mikroskopie als auch in der Durchflusszytometrie eingesetzt. Sie zeigen wenig Fluoreszenzüberlappungen mit grün fluoreszierenden Farbstoffen und kaum oder gar keine mit länger wellig emittierenden Fluorochromen. Allerdings neigen alle Fluorochrome die im blauen Bereich angeregt werden dazu schnell auszubleichen. Aufgrund dieser kritischen optischen Eigenschaft wird AMCA nicht für Einzelmarkierungen empfohlen. Wird dieser blaue Fluoreszenzfarbstoff bei Mehrfachmarkierungen in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, sollte das am stärksten exprimierte Antigen mit ihm nachgewiesen werden, da das menschlichen Auge diese Farbe schlechter wahrnimmt als andere Farben. Dabei kann AMCA mit einer Quecksilberlampe angeregt und die Fluoreszenz bei Verwendung eines UV-Filtersatzes betrachtet werden. Möglichkeiten die Sichtbarkeit von AMCA zu verbessern, umfassen die Dunkelanpassung der Augen, die Verwendung von Fluorit anstelle von Glasobjektiven, die Vermeidung von UV-Licht absorbierenden Eindeckmitteln (z. B. Plastik-basierte Medien) und die Asuwertung mit blaulicht-empfindlichen Sensoren. Wegen der ungünstigen Ausbleicheigenschaften von AMCA in der konfokalen und konventionellen Fluoreszenz-Mikroskopie, empfiehlt sich der Einsatz von Antifading-Reagenzien wie ImmunonoSelect® Anti-Fading oder Eindeckmittel mit Zusatz von Anti-Fading Reagenzien wie z. B. n-Propylgallat (2 % n-Propylgallatin 80-90 % Glycerol in PBS (pH 7,2 – 9,0)). In der Durchflusszytometrie kann AMCA mit einer Quecksilberdampflampe oder einem wassergekühlten Argonionen-Laser, der Emissionswellenlängen im UV-Bereich besitzt, angeregt werden. Wegen des relativ schwachen Signal und des schnellen Ausbleichen wird AMCA nicht für die Einphotonen induzierte Fluoreszenzmikroskopie empfohlen. Allerdings hat sich AMCA für die Zweiphotonen-Mikroskopie als signalintensiv und fotostabil erwiesen.

AMCA-Konjugat

Brilliant Violet™ BD

Brilliant Violet Konjugate BV421™ und BV480™ bieten mehr Möglichkeiten im blauen Farbkanal für Mehrfachmarkierungen. Hiermit können bis zu 5 Fluoreszenzfarbstoffe verwendet werden.

Brilliant Violet 421™ (BV421™)

Brilliant Violet 421™-Konjugate (Amax 407 nm, Emax 421 nm) eignen sich besonders für Mehrfachmarkierung in Kombination mit BV 480™, Alexa Fluor® 488, Rhodamine Red™-X, und Alexa Fluor® 657. Achtung, aufgrund ihrer physischen Eigenschaften neigen auch Brilliant Violet 421™-Konjugate, die im blauen Bereich angeregt werden dazu schneller auszubleichen als Farbstoffe mit höherwelliger Anregung!

Brilliant Violet 421-Konjugat

Brilliant Violet 480™ (BV480™)

Brilliant Violet 480™-Konjugate (Amax 436 nm, Emax 478 nm) eignen sich besonders für Mehrfachmarkierung in Kombination mit BV 421™, Alexa Fluor® 488, Rhodamine Red™-X, und Alexa Fluor® 657.

Brilliant Violet 480-Konjugat

Erfahren Sie hier mehr über BD Brilliant Violet™ Sekundärantikörperkonjugate.

Cyanin (Cy™)-Farbstoffe

Cyanin (Cy™)-Farbstoffe gehören zu einer Fluorochrom-Familie der zweiten Generation. Sie sind photostabiler und leuchtintensiver als zum Beispiel FITC oder TRITC. Während Cy3-Konjugate aufgrund ihrer besonderen Leuchtkraft und Fotostabilität durchgängig erhältlich waren, hatte der Hersteller Jackson ImmunoResearch die Produktion von Cy2- und Cy5- Konjugaten eingestellt und durch die leuchtstärkeren Farbstoffe Alexa Fluor® ersetzt. In verschiedenen Laboren wurde nun gezeigt, dass generell alle Cyanine bei Verwendung von organischen Eindeckmitteln und der damit einhergehenden starken Dehydrierung beim Einbettprozess zu besseren Färbeergebnissen führen. Jackson ImmunoResearch hat deshalb ausgewählte Cy2- und Cy5-Konjugate, konjugiertes Streptavidin und konjugierte IgG Kontrollen – insbesondere für die Mehrfachmarkierung – wieder in das Programm aufgenommen.

Cy2™ (Carbocyanin)

Cy2™ (Carbocyanin) (Amax 492 nm, Emax 510 nm) hat ähnliche spektrale Eigenschaften wie FITC und kann mit den gleichen Filtersets dargestellt werden. Beim Einsatz von Antifading-Reagenzien ist zu beachten, dass es sensitiv gegenüber N-Phenylendiamin ist, das in einigen kommerziellen Antifading-Medien vorkommt.

Cy2-Konjugat

Cy2-Konjugat Cy3™ (Indocarbocyanin)

Cy3™ (Indocarbocyanin) (Amax 550 nm, Emax 570 nm) ist leuchtstärker, fotostabiler und zeigt weniger Hintergrund als TRITC und die meisten anderen Fluoreszenzfarbstoffe. Cy3-Konjugate können ohne apparativen Mehraufwand mit einem konventionellen TRITC-Filtersatz verwendet werden, da die Anregungs- und Emissionsspektren mit denen von Tetramethylrhodamin (TRITC) nahezu identisch sind. Spezielle Cy3-Filter (z.B. Fa. Zeiss Filtersatz 20) sind ebenfalls von verschiedenen Anbietern erhältlich. Cy3 kann zu 50% seiner Maximalabsorption mit den 514 nm- oder 528 nm-Strahlen eines Argon-Lasers angeregt werden, zu 75% des Maximums mit einem Helium-Neon-Laser (bei 543 nm) oder mit einer Quecksilberlampe (bei 546 nm). Cy3 wird häufig mit einem im grünen Spektrum fluoreszierenden Farbstoff für Doppelmarkierungen eingesetzt. Wegen der spektralen Überlappung der Fluoreszenzemission ist zur Minimierung der Cy3-Fluoreszenz im Filtersatz des Grünfarbstoffs allerdings die Verwendung eines engen Bandpassfilters für den grünen Kanal empfehlenswert. Steht ein konfokales Mikroskop mit einem Krypton-Argon-Laser und einem Infrarot-Detektor (CCD) zur Verfügung, kann Cy3 für Mehrfachmarkierungen auch mit Farbstoffen im nahen Infrarotbereich wie Alexa Fluor 647 kombiniert werden.

Cy3-Konjugat

Cy5™ (Indodicarbocyanine)

Cy5™ (Indodicarbocyanin) (Amax 650 nm, Emax 670 nm) eignet sich wegen seiner minimalen Überlappung zu anderen Fluorochromen vor allem für Mehrfachmarkierungen. Da die Fluoreszenz von Cy5 mit dem menschlichen Auge nicht ausreichend wahrgenommen werden kann, kann Cy5 mit einem konventionellen Epifluoreszenzmikroskop nicht optimal bzw. kaum sichtbar gemacht werden, zumal die Quecksilberlampe, die in den meisten Geräten verwendet wird, nicht genügend Licht innerhalb des Anregungsbereiches von Cy5 emittiert. Der Farbstoff eignet sich deshalb vorzugsweise für den Einsatz in der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie. Cy5 kann durch einen Krypton/ Argon-Laser (98% der Maximalabsorption mit 647 nm Wellenlänge), einem Helium/Neon-Laser (63% der Maximalabsorption mit 633 nm Wellenlänge) oder mit einem roten Dioden-Laser angeregt werden.

Cy5-Konjugat

DyLight™ -Farbstoffe

DyLight™-Farbstoffe gehören zu einer den Alexa-Farbstoffen vergleichbaren Familie von Fluorochromen mit verbesserter Helligkeit und Fotostabilität. Sie sind hochgradig wasserlöslich und behalten ihre Leuchtkraft in einem pH-Bereich von 4 bis 9.

DyLight™ 405

DyLight 405-konjugierte Antikörper (Amax 400nm, Emax 421nm) sind sehr hell und fotostabil, jedoch ist ihr Einsatz auf konfokale Mikroskope mit einem 405 nm-Laser und geeignetem Emissionsfilter beschränkt. Hier kann DyLight 405 sowohl in wässrigen als auch in permanenten Eindeckmedien mit hoher Farbtrennung und Sensitivität wirkungsvoll für Vierfarben-Imaging im blauen Bereich eingesetzt werden. In Kombination mit Alexa 488, Rhodamin Red-X und Alexa 647 lässt sich die beste Farbtrennung erzielen. Bei einer etwas geringeren Farbtrennung ist der Einsatz von Cy3 anstelle von Rhodamin Red-X ebenfalls möglich. Bei Verwendung wässriger Eindeckmedien empfiehlt sich der Zusatz von n-Propylgallat gegen das Ausbleichen der Fluoreszenz (Eindeckmedium z. B. n-Propylgallat-Glycerol). Wie bei allen Fluorophoren die im blauen Bereich angeregt werden, ist die fotostabilität im Vergleich zu höherwelliger Anregung geringer. Der Einsatz von DyLight 405 in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie sowie in der Durchflusszytometrie wird nicht empfohlen, da hier die optimalen Filtersets/Anregungsquellen meist nicht vorhanden sind.

Dylight-405 Konjugat

Weitere DyLight-Antikörperkonjugate finden Sie hier.

FITC (Fluorescein-Isothiocyanat)

FITC (Amax 492 nm, Emax 520 nm) ist ein Fluoresceinderivat, welches aufgrund seiner langen Geschichte auch heute noch häufig eingesetzt wird. FITC ist die Fluorescein-Form, die mit Ausnahme von Streptavidin an alle Antikörper und Proteine von Jackson ImmunoResearch Labs gekoppelt ist. Zu den schwerwiegendsten Nachteilen gehört das schnelle Ausbleichen (Fading) und die im Verhältnis zu neueren Fluorophoren geringe Leuchtkraft. Wegen der ungünstigen Ausbleicheigenschaften empfiehlt sich beim Einsatz von FITC-konjugierten Antikörpern die Zugabe von Antifading-Reagenzien. Alternativen mit besseren Fading-Eigenschaften bei gleicher Anregung sind deshalb Cy2™ (Carbocyanin) oder Alexa Fluor® 488. DTAF (Dichlorotriazinylamino-Fluorescein) und FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) sind Derivate desselben Fluoresceinmoleküls, weshalb DATF identische Anregungs- und Emissionmaxima wie FITC besitzt. Zur Kopplung an Streptavidin verwendet Jackson ImmunoResearch Labs DTAF anstelle von FITC, da die Fluoreszenz von FITC nach Kopplung an Streptavidin erheblich gelöscht wird (Effekt der Fluoreszenzlöschung/ Quenching-Effekt). Dieses Phänomen ist einzigartig für Streptavidin und wird bei Kopplung an Antikörper nicht beobachtet. Auch für Streptavidin-Konjugate gilt, dass Alternativen mit besseren Fading-Eigenschaften die Farbstoffe Cy2™ (Carbocyanin) oder Alexa Fluor® 488 sind.

FITC-Konjugat

TRITC, Rhodamin Red™-X und Texas Red®

TRITC, Rhodamin Red-X und Texas Red sind Rhodaminderivate, die im orangen bzw. roten Bereich des sichtbaren Spektrums fluoreszieren. Konjugate dieser Rhodamin-Farbstoffe besitzen jeweils verschiedene Anregungsmaxima (550, 570 und 596 nm) und Emissionsmaxima (570, 590 und 620 nm). Alle drei Fluorochrome sind für Doppelmarkierungen in Kombination mit FITC oder Alexa Fluor 488 geeignet. Obwohl in Doppelmarkierungen traditionell meist TRITC mit FITC kombiniert worden ist, lässt sich mit Rhodamin Red-X oder Texas Red wegen der geringeren Überlappung mit dem FITC-Spektrum eine bessere Farbtrennung erzielen. Als hintergrundärmere, hellere und stabilere Alternative zu Texas Red empfiehlt sich die Verwendung von Alexa Fluor 594-Konjugaten. Ebenso stellt Cy3 eine leuchtstärkere Alternative zu TRITC dar. Zur Doppelmarkierung mit FITC in der Durchflusszytometrie wird Phycoerythrin (anstelle von Rhodamin) empfohlen, da beide Fluorophore mit einem Argon-Laser (488 nm) angeregt werden können.

Rhodamin Red™-X (RPX)

Rhodamin Red™-X (Rhod. Red-X, RRX) ist wegen seiner spektralen Eigenschaften ein nahezu ideales Fluorochrom für Drei- und Vierfachmarkierungen mit DyLight 405, Alexa Fluor 488, und Alexa Fluor 647 bei Verwendung eines mit einem 405 nm-Laser und einem Krypton-Argon-Laser ausgestatteten konfokalen Lasermikroskops. Die Fluoreszenzemission von Rhodamin Red-X liegt ungefähr mittig zwischen der von Alexa Fluor 488 und Alexa Fluor 647 und zeigt nur wenig Überlappung mit diesen Farbstoffen. Außerdem können alle drei Fluorochrome durch den bei konfokalen Lasermikroskopen meist vorhandenen Krypton-Argon-Laser ohne relevanten Empfindlichkeitsverlust detektiert werden, da die emittierten Laserstrahlen bei 488 nm, 568 nm und 647 nm Wellenlänge jeweils die optimalen Anregungswellenlänge für Alexa Fluor 488 (FITC), Rhodamin Red-X und Alexa Fluor 647 darstellen. Durch das Aufschalten eines 405 nm-Lasers wird die Vierfarbenmarkierung mit DyLight 405-konjugierten Sekundärantikörpern möglich. In der konventionelle Fluoreszenzmikroskopie sind Rhodamin Red-X-Konjugate besonders zur Kombination mit grün fluoreszierenden Farbstoffen (Alexa Fluor 488) geeignet. Möglich ist auch der simultane Einsatz Rhodamin Red-X -gekoppelter Antikörper mit blau fluoreszierenden AMCA-Konjugaten für Doppelmarkierungen.

Rhodamin Red™-X Konjugat

R-Phycoerythrin (R-PE), Allophycocyanin (APC) und Peridinin-Chlorophyll (PerCP)

R-PE (240 kDa), APC (104 kDa) und PerCP (35 kDa) gehören zu den lichtsammelnden Phycobiliproteinen, einer Familie natürlich auftretender, fluoreszierender Makromoleküle aus den Photosynthese-Systemen verschiedener Algen. Da Phycobiliproteine mehr als 30 kovalent gebundene Tetrapyrrol-Pigmente, sogenannte Phytochromobiline, besitzen, sind die Fluroeszenzsignale besonders intensiv. In den Photosynthese-Systemen der Algen dienen diese Moleküle der Absorption und Weiterleitung von Licht(-energie) durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) an das Chlorophyll der photosynthetischen Reaktionszentren. Die Anordnung der Pigmente im Protein ist natürlicherweise so optimiert, dass maximale Lichtsammlung und Fluoreszenz bei minimaler Fluoreszenzlöschung durch innere oder äußere Umgebungseinflüsse erzielt werden können. Nach der Konjugation der Phycobiliproteine an die hochaufgereinigten Sekundärantikörper ist die Fluoreszenzlöschung (quenching) im Gegensatz zu konventionellen Flurophor-Antikörper-Konjugationen deshalb sehr gering. Antikörper-Konjugate mit Phycobiliproteinen besitzen eine sehr hohe spezifische Fluoreszenzaktivität bei hohen Extinktionskoeffizienten und somit eine sehr hohe Quantenausbeute (quantum yield). Die Fluoreszenz einiger Phycobiliproteine entspricht etwa der von 30 Fluorescein- bzw. 100 Rhodamin-Molekülen bei einer vergleichbaren Anregung. Phycobiliprotein-Konjugate lassen sich über einen breiten Wellenlängenbereich anregen und zeichnen durch große Stokes-Verschiebungen ihrer Emissionsmaxima in langwelligere Bereiche aus. Weitere Vorteile von Antikörper-Konjugaten mit Phycobiliproteinen sind deren hohe Stabilität, eine gute Wasserlöslichkeit und eine hohe pH-Unempfindlichkeit der Fluoreszenz. Diese Eigenschaften, zusammen mit der hohen Fluoreszenzintensität, haben sich besonders in auf Laser-Anregung basierenden Techniken wie der Durchflusszytometrie bewährt. PerCP, Alexa Fluor 488 (oder FITC) und R-PE werden mit der 488 nm-Hauptlinie eines Argon-Lasers angeregt und können so für Einfach-, Doppel- oder Dreifachfärbungen mit Einzellaser-Durchflusszytometern verwendet werden. APC oder auch Alexa Fluor 647 können durch Anregung bei 633 oder 635 nm mit einem Doppellaser-Durchflusszytometer als vierte Farbe eingesetzt werden. Die relativ hohen Molekulargewichte von R-PE, APC und PerCP lassen die Verwendung in Verfahren, die eine gute Durchdringung von Zellen und Geweben erfordern, nur eingeschränkt zu. Sie eignen sich damit überwiegend zur Oberflächenmarkierung von Zellen in der Durchflusszytometrie. R-PE und APC können durch Licht eines breiten Bereich des sichtbaren Spektrums angeregt werden, sind hochgradig wasserlöslich, haben relativ niedrige isoelektrische Punkte und sind frei von potentiell klebrigen Kohlenhydraten. Sie sind besonders für Anwendungen, die entweder eine hohe Sensitivität, eine gute Farbtrennung oder eine Mehrfachmarkierung erfordern, geeignet.

R-Phycoerythrin (R-PE)

Das 240 kDa große Phycobiliprotein R-PE wird aus makrophytischen Algen (seaweed) isoliert. Das Absorptionsmaximum liegt bei einer Wellenlänge von 490 nm, mit einem kleineren Adsorptionspeak bei 545/566 nm und emittiert Licht mit einer maximalen Fluoreszenz bei 580 nm.

R-Phycoerythrin-Konjugat

Allophycocyanin (APC)

APC ist ein aus blau-grünen Spriulinia-Algen isoliertes Phycobiliprotein, das zur Stabilisierung chemisch vernetzt wird. Es enthält die chromophore Gruppe Phycocyanobilin, mit einem Absorptionsmaximum bei 650nm und einer maximalen Emission bei 660nm.

Allophycocyanin-Konjugat

Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP)

PerCP ist ein aus Dinoflagellaten (Dinophyceae sp.) gewonnener Peridinin-Chlorophyll-Komplex von ca. 35,5 kDa. Es hat ein breites Anregungsspektrum mit einem Hauptabsorptionspeak bei 482 nm, einem zweiten Absorptionspeak bei 442 nm und einer langen Stokes-Verschiebung zu einem Emissionsmaximum bei 677 nm.

Peridin-Chlorophyll-Protein

Alexa Fluor®, Rhodamin RedTM-X und Texas Red® sind eingetragene Marken von Life Technologies, Inc.*. Cy™ ist eine Marke von GE Healthcare (Patent 5.268.486). Brilliant Violet™ ist ein Markenzeichen von Sirigen Inc., a Becton, Dickinson and Company affiliate. DyLight™ ist ein Markenzeichen von Thermo Fisher Scientific. Über alle Farbstoffe und deren Farbstoffprodukte besitzt Jackson ImmunoResearch Labs mit den genannten Firmen Lizenzvereinbarungen zu den Farbstoff-Technologien bezüglich Verwendung, Herstellung, Handel und Verkauf.

Alle Abbildungen Jackson ImmunoResearch.

Mehrfachmarkierung mit Sekundärantikörpern

Die Auswahl von Sekundärantikörpern zur simultanen Detektion von mehr als einem Antigen hängt von wenigstens zwei wichtigen Kriterien ab:

A) Verfügbarkeit von Sekundärantikörpern, die
1. von derselben Wirtsspezies stammen, so dass sie einander nicht erkennen,
2. keine anderen Primärantikörper im Versuchssystem erkennen,
3. keine Immunglobuline anderer Spezies erkennen, die möglicherweise im Versuchssystem präsent sind, und
4. nicht mit dem untersuchten Gewebe oder Zellmaterial kreuzreagieren

B) Verwendung von Labeln (Fluorochrome, Enzym-Reaktionsprodukte, elektronendichte Partikel), die optisch gut aufgelöst werden können.

Die mit MinX (Minimal Cross-Reactivity/Reaction) gekennzeichneten, affinitätsgereinigten Antikörper werden speziell hergestellt, um diese Kriterien zu erfüllen. Sie wurden mittels ELISA als nicht kreuzreaktiv getestet und sind gegen IgG und/oder Serumproteine anderer Spezies adsorbiert.
Ihre Kreuzreaktivität (X) mit Immunglobulinen dieser angegebenen Spezies ist „minimal“ (Min), d. h. unterhalb 1%.
(Ha = Armenischer Hamster, Hs = Syrischer Hamster, Ck = Huhn, Hu = Human, Rb = Kaninchen, Ms = Maus, Gp = Meerschweinchen, Ho = Pferd, Rt = Ratte, Bo = Rind, Sh = Schaf, Sw = Schwein, Go = Ziege)

Das folgende Schema zeigt ein Beispiel für den Einsatz solcher Kreuzreaktions-minimierten Antikörper in einer Mehrfachmarkierung. Die in Schritt 3 verwendeten Sekundärantikörper erkennen sich gegenseitig nicht, da sie alle aus Esel stammen. Durch die Festphasen-Präadsorption gegen Serumproteine der Primärantikörper-Spezies erkennen sie auch nicht die anderen Primärantikörper aus Schritt 2. Ebenso reagieren sie nicht mit den möglicherweise im Rattengewebe vorhandenen Ratte-Immunglobulinen und Serumproteinen. Jedoch geht die durch Ig/ Serumprotein-Adsorptionen gewonnene Erhöhung der Spezifität auf Kosten der Sensitivität: Esel-Sekundärantikörper, die gegen Serumproteine von bis zu zehn verschiedenen Spezies adsorbiert wurden, sind weniger affin als Ziege-Sekundärantikörper, die gegen Ig/ Serumproteine von drei bis fünf verschiedenen Spezies adsorbiert worden sind.

Hinweis: Antikörper, die gegen eine nahe verwandte Spezies adsorbiert wurden, weisen z. T. eine reduzierte Epitoperkennung auf und können monoklonale Antikörper mit seltenen IgG-Subklassen (IgG2b, IgG3), die weitestgehend homolog mit der Spezies sind, gegen die präadsorbiert wurde, nur eingeschränkt erkennen.

Dreifachmarkierung von Rattengewebe

Mehrfachmarkierung mit Sekundärantikörper

* Siehe auch: Beispiel Fab-Blocking von Gewebe

Hinweis: Der Nachweis von Antigen A, B und C kann parallel oder sukzessiv erfolgen. Im Parallelansatz werden die Antikörper in Schritt 2 (b, d, f) und 3 (c, e, g) in einem Cocktail aufgetragen, im Sukzessivansatz wird von a) bis g) jeweils in Einzelschritten nacheinander inkubiert. In beiden Vorgehensweisen wird zwischen den Antikörper-Inkubationen und nach der Blockierung (a) jeweils gründlich gewaschen. Bei starkem Hintergrund kann im Sukzessivansatz eine wiederholte Blockierung vor Schritt d) und f) erforderlich sein. Die Mehrfachmarkierung kann im Parallelverfahren durchgeführt werden, wenn das Färbe- und Hintergrundverhalten der Antikörper sich durch Mischung im Vergleich zu Einzelmarkierungen (Sukzessivfärbungen) nicht verändert. In Mischung können Antikörper (Immunglobuline) aufgrund spezifischer oder unspezifischer Wechselwirkungen miteinander reagieren und den Antigennachweis erschweren. Aus diesem Grund sollte dem Antikörperverdünnungspuffer außerdem kein Normalserum zugesetzt werden.

Weitere Tipps und Tricks:

Eine gute Übersicht über das Mehrfarben-Immunfluoreszenz-Labeling in der konfokalen Mikroskopie gibt der Beitrag von Brelje, Wessendorf und Sorenson, “Multi-color laser scanning confocal immunofluorescence microscopy: Practical application and limitations.” In Cell Biological Applications of Confocal Microscopy, B. Matsumoto. Orlando, FL: Academic Press, Inc. (Methods Cell. Biol. 1993, Vol. 38, 97; Methods Cell. Biol. 2002, Vol. 70, 165).

Beispielprotokoll: Vierfach-Immunfluoreszenzmarkierung im Parallelansatz

Vierfachmarkierung der Kalzium-bindenden Proteine Calbindin, Parvalbumin und Calretinin sowie perineuronaler Netze

(nach: Härtig et al. 1996, J. Neurosci. Methods 67: 89-95 und Schwaller et al. 1999, J. Neurosci. Methods 92: 137-144)

Mehrfachmarkierung_479_cff889bf65

Hippocampus der Ratte: A) Biotinyliertes Solanum tuberosum Agglutinin/Alexa Fluor 488-Streptavidin (Gefäße), B) Kaninchen-anti-GFAP/Cy3-Esel-anti-Kaninchen (Astroglia), C) Maus-anti-NeuN/AlexaFluor 647-Esel-anti-Maus (MinX Ratten IgG; neuronale Kerne), D) “Merge” (W. Härtig, Paul Flechsig Institute for Brain Research, University of Leipzig, Germany)

Die Cytochemie Kalzium-bindender Proteine ist oft eine Methode der Wahl zur Darstellung morphologischer Details immunpositiver Nervenzellen. Eine Mehrfachmarkierung dieser Marker tragen zur Aufklärung von komplizierten Struktur-Funktions-Beziehungen im Zentralnervensystem bei.

Material: 30 µm-dicke, frei bewegliche Gefrierschnitte von Paraformaldehyd-fixiertem Rattenhirn.*
Hinweis: Die Schnitte werden frei flottierend in Vertiefungen von Mehr-Well-Platten gefärbt/gewaschen und erst nach der Färbung auf Objektträger aufgezogen. Das Transferieren der Schnitte in einzelne Wells erfolgt mit Hilfe eines geeigneten Pinsels.

Alle Schritte bei Raumtemperatur durchführen:

1. 3 x 10 min Waschen des Gewebes mit 0,1 M Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,4

2. Blocken unspezifischer Bindungsstellen des Gewebes mit 5% Esel-Normalserum (Kat.-Nr. 017-000-121) in TBS + 0,3% Triton X-100 (= ENS-TBS-T); 1 h

3. Inkubation mit einem Cocktail primärer Antikörper und Wisteria floribunda Agglutinin in ENS-TBS-T; 16 h* bei Raumtemperatur:
• Maus-anti-Calbindin [1:200; Klon CL-300; Sigma]
• Kaninchen-anti-Parvalbumin [1:500; Swant]
• Ziege-anti-Calretinin [1:100; Swant]
• Biotinyliertes, reduziertes Wisteria floribunda Agglutinin (20 µg/ml; Sigma)

4. 3 x 10 min Waschen der Schnitte mit TBS

5. Inkubation mit einem Cocktail sekundärer fluorochromierter Antikörper, verdünnt mit TBS (+ 2% Rinderserumalbumin, z.B. Fraktion V)]; 1 h:
• Alexa Fluor 488-Esel-anti-Maus IgG (Kat.-Nr.: 715-545-151; 20 µg/ml)
• Cy3-Esel-anti-Kaninchen IgG (711-165-152; 20 µg/ml)
• AMCA-Esel-anti-Ziege IgG (705-155-147; 30 µg/ml)
• Alexa Fluor 647-Streptavidin (016-600-084; 20 µg/ml)

6. 3 x 10 min Waschen der Schnitte mit TBS und mit destilliertem Wasser (1 min)

7. Aufziehen der Schnitte auf fluoreszenzfreie Objektträger; Lufttrocknung

8. Eindecken z.B. mit Entellan (in Toluen; Merck) oder mit einem wässrigen Eindeckmedium.


* Bitte beachten Sie: Dies ist kein Standardprotokoll. Die Inkubationszeit für die Primärantikörper ist abhängig von den Antikörpereigenschaften und der Dicke der Gewebeschnitte. Sie kann von 1 h bis mehreren Stunden bei Raumtemperatur bis zu einigen Tagen bei 4°C variieren.


Immunfluoreszenznachweis-Methoden lassen sich auch an Paraffin- und Kryostatschnitten sowie an Wholemounts durchführen, vorausgesetzt es stehen geeignete Primärantikörper zur Verfügung. Zur empfindlichen Darstellung bestimmter, oft Membran-assoziierter Antigene behandelt man die Gewebe während der histochemischen Verfahren mit Detergenzien (häufig verwendet: 0,1-1% Triton X-100, das oft der Blockierlösung für die Primärantikörper zugefügt wird). Weil Triton irreversibel wirkt, reicht sein einmaliger Einsatz während der Versuche und es kann auf seinen Zusatz zu Sekundärantikörpern verzichtet werden. Durch höhere Tritonanteile in Inkubationslösungen, die für verschiedenene immunhistochemische Verfahren eingesetzt werden, können Artefakte wie z.B. Myelinfärbungen auftreten (siehe Weruaga et al. 1998).

anti-Hapten Konjugate für FISH

Western Blot – Anti-IgG, Fc spezifische MinX-Sekundärantikörper

Western Blot – Anti-(Sub-)Klassen-spezifische MinX-Sekundärantikörper

Anti-IgG/M (H+L) ohne Spezies-Kreuzreaktion (MinX) für den Western Blot

Affinitätsgereinigte monovalente Fab-Fragmente

Fab-Fragment

Fab-Fragmente eignen sich dazu, die Oberfläche von Immunglobulinen sterisch zu blockieren. Dies macht es möglich, Primärantikörper aus derselben Spezies in einer Doppelfärbung zu detektieren oder um zell- oder gewebeeigene Immunglobuline zu blockieren, um so Hintergrundfärbung zu reduzieren.
Monovalente Fab-Fragmente besitzen nur eine Bindungsstelle für Antigene. Im Gegensatz dazu verfügen komplette IgG-Moleküle und IgG F(ab’)2-Fragmente über zwei Bindungsstellen für Antigene.
Nur diese Eigenschaft der monovalenten Fab-Fragmente macht die  Anwendung für die oben genannten Zwecke möglich, da IgG-Gesamtmoleküle und F(ab’)2-Fragmente einen zweiten Primärantikörper aus derselben Spezies binden können und zu einer ungewollten Doppelmarkierung führen!
Fab-Fragmente sind nicht gegen Serumproteine anderer Spezies  präadsorbiert.
Zell- oder gewebeeigene Immunglobuline (z.B. in Mausgewebe) können durch 30–60 min Inkubation des Gewebes mit
10–100 µg/ml unkonjugiertem Fab-Fragment (z.B. Ziege anti-Maus IgG) blockiert werden.

Eine Übersicht aller erhältlichen konjugierten und unkonjugierten Fab-Fragmente erhalten Sie in der Produktauswahl Sekundärantikörper bei gewählter IgG-Form: IgG, Fab-Fragment.

Anti-Hapten Konjugate in immunhistologischen Färbungen

Anti-Hapten-Systeme können sehr gut in Mehrfachmarkierungen mit haptenylierten Primärantikörpern eingesetzt werden (Abb. 1). Besonders dann, wenn sich Primärantikörper nicht mit Spezies- oder Subklassen-spezifischen Sekundärantikörper-Konjugaten unterscheiden lassen, garantieren sie eine empfindliche und differenzierte Darstellung der Antigene.

Fluorescein-anti-Fluorescein-Markierungen

Anti-Fluorescein Antikörper bilden neben ihrer besonderen Eignung für Mehrfachmarkierungen eine hervorragende Grundlage für die nachfolgende Signalverstärkung durch Markerenzyme, Fluoreszenz- und Immungold-Markierungen. Ein wesentlicher Vorteil von Fluorescein-anti-Fluorescein Techniken gegenüber anderen Hapten-anti-Hapten-Verfahren sowie (Strept)Avidin-Methoden besteht darin, dass Hapten-Signale detektiert werden können oder ihre Konzentration durch Absorption in Lösung messbar ist, bevor der sekundäre Nachweisschritt folgt. Außerdem kann durch ein auf Fluorescein-anti-Fluorescein basiertes Nachweissystem unerwünschte Hintergrundfärbung zelleigenen Biotins umgangen werden.

Abbildung 1
Abbildung 1

Peroxidase-markierte Antikörper gegen Fluorescein erlauben die Umwandlung des Fluoreszenz-Signals Fluorescein-konjugierter Nachweisreagenzien in ein lichtmikroskopisch sichtbares und elektronendichtes Reaktionsprodukt (Abb. 2). Der Einsatz dieser Konjugate steigert die Nachweisempfindlichkeit erheblich, erfordert aber auch eine sorgfältige Optimierung der Konzentration von Fluorescein-konjugierten Markern. So reicht bereits ein Zehntel der für die Durchflusszytometrie angegebenen Einsatzkonzentration eines Fluorescein-konjugierten CD-Markers, um in einer immunhistochemischen Färbung mit Peroxidase-konjugiertem anti-Fluorescein Antikörper ein deutliches Signal zu erhalten (Abb. 2). Konjugate aus Markerenzymen und anti-Fluorescein Antikörper lassen sich außerdem in ELISAs oder zum Nachweis Fluorescein-markierter Proben auf Blot-Membranen einsetzen.

Abbildung 2 (1* und 2*)
Abbildung 2 (1* und 2*)

Abb. 2: Konvertierung von Fluoreszenz in ein lichtmikroskopisch sichtbares Reaktionsprodukt.(A) Mikroglia in autoptischem corticalen Hirngewebe. Umwandlung der relativ schwachen Fluoreszenz-Markierung mit Fluorescein anti-CD45 durch Peroxidase-markierten anti-Fluorescein Antikörper (#200-032-037) und das Chromogen Nickel-verstärktes Diaminobenzidin (DAB). (B) Perineuronale Netze der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Konversion grünfluoreszierender Lektin-Bindungsstellen für Fluorescein-markiertes Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) durch Peroxidase-konjugierten anti-Fluorescein Antikörper (# 200-032-037) und Nickel-verstärktes DAB.

Abbildung 3
Abbildung 3

Mit Alexa Fluor 488 oder anderen Grünfarbstoffen markierte anti-Fluorescein Antikörper eignen sich dazu, die Grünfluoreszenz des an einen Antikörper, eine Nukleinsäure oder anderen Biomoleküls gekoppelten Haptens Fluorescein zu verstärken, ohne dessen Fluoreszenzfarbe zu ändern (Abb. 3). Fluorescein-gekoppelte Marker sind bei nachträglicher Amplifizierung in einer höheren Verdünnung einsetzbar als ohne Signalverstärkung. Darüber hinaus ist die Alexa Fluor 488-Fluoreszenz weniger empfindlich gegenüber Fading als die des Fluoresceins.

Abb. 3: Verstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein. Perineurales Netz der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Farbverstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein-konjugiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) mit grün-markiertem anti-Fluorescein Antikörper (z.B. #200-542-037).

Abbildung 4
Abbildung 4

Mit leuchtenden Rotfarbstoffen wie Cy3 markiertes anti-Fluorescein kann genutzt werden, um die Grünfluoreszenz eines Fluorescein-Konjugates in eine photostabile Rot-Fluoreszenz umzuwandeln und dadurch das Signal von Fluorescein-Konjugaten zu verstärken (Abb. 4).

Abb. 4: Umwandlung der Grünfluoreszenz in ein stabil rot fluoreszierendes Signal. Doppelmarkierung eines perineuronalen Netzes der extrazellulären Matrix (rot) und Blutgefäßen (blau) im Ratten-Neocortex. Netzdarstellung mit Fluorescein-markiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) gefolgt von Cy3-markiertem anti-Fluorescein Antikörper. Gefäßmarkierung mit biotinyliertem Kartoffel-Lektin (Solanum tuberosum Agglutinin) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084).

Abbildung 5
Abbildung 5

Gemeinsam mit anti-Digoxin oder anti-Biotin (oder Streptavidin) können anti-Fluorescein-Konjugate für Doppel- und Mehrfachfärbungen mit Hapten-konjugierten Markern eingesetzt werden (Abb. 5). Peroxidase-Konjugate von Antikörpern gegen Haptene ermöglichen in CARD-Nachweissystemen im Zusammenspiel mit Fluoreszenz-markierten Tyramid-Derivaten eine erheblich verbesserte Nachweisempfindlichkeit.

Abb. 5: Hapten-anti-Hapten-Mehrfach-Markierung. Dreifachmarkierung von Gefäßen, perineuronalen Netzen der extrazellulären Matrix und Astroglia im Cortex der Ratte. Die Färbung der Blutgefäße (blau) erfolgte mit biotinyliertem Lektin (Solanum tuberosum) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084). Perineuronale Netze (grün) wurden mit Fluorescein-markiertem Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) und nachfolgend grün-markiertem anti-Fluorescein (z.B. # 200-542-156) dargestellt, während digoxigenyliertes anti-GFAP und Cy3-konjugiertes anti-Digoxin (200-162-156) der Detektion von Astroglia diente.

* Literatur – Anwendungsbeispiele

Abbildungsnachweis: (*1) Alle abgebildeten Präparate stammen von Wolfgang Härtig aus dem Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung (PFI) der Universität Leipzig. Die Abbildungen von Fluoreszenzmarkierungen wurden an einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM) 510 Meta von Jens Grosche (PFI) angefertigt. (*2) Die Aufnahmen der Immunperoxidase-Markierungen erfolgten durch Uli Gärtner (PFI) an einem Axiophot, ausgestattet mit einer AxioCam HRC sowie dem Programm AxioVision 3.1.2.1.

Verdünnung von Sekundärantikörpern

Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch werden mit der höchsten Verdünnung in Immunoassays eingesetzt. Unsere Empfehlungen für den erfolgreichen Einsatz in ELISA, Western Blot, Histo- / Cytochemie und Durchflusszytometrie (FACS) haben wir in folgenden Übersicht zusammengestellt. Da die optimale Verdünnung von unterschiedlichen Faktoren abhängen kann, sollte jeder Anwender die richtige Gebrauchsverdünnung für sein Experiment empirisch bestimmen.

Sekundärantikörper

ProduktKonjugatELISAWestern BlotHisto- / CytochemieDurchflusszytometrie
Gesamt IgG und F(ab’)2Unkonjugiert10 – 20 µg/ml10 – 20 µg/ml10 – 20 µg/ml10 – 20 µg/ml
FabUnkonjugiert20 – 40 µg/ml20 – 40 µg/ml20 – 40 µg/ml20 – 40 µg/ml
Gesamt IgG, F(ab’)2 und FabAlexa Fluor 488, 594, 647 und Cy31:100 – 1:8001:100 – 1:800
Gesamt IgGAlexa Fluor 680 und 7901:50.000 – 1:200.000
Gesamt IgGBV421 und BV4801:50 – 1:2001:50 – 1:200
Gesamt IgG, F(ab’)2 und FabAMCA, Cy2, FITC, TRITC, RRX1:50 – 1:2001:50 – 1:200
Gesamt IgGCy51:100 – 1:4001:100 – 1:400
Gesamt IgG und F(ab’)2R-PE und APC1:50 – 1:200
Gesamt IgG und F(ab’)2PerCP1:25 – 1:100
Gesamt IgG und F(ab’)2Horseradish Peroxidase (HRP)1:5.000 – 1:100.0001:5.000 – 1:100.000 ; 1:10.000 – 1:200.000 (ECL)1:200 – 1:5.000
Gesamt IgG und F(ab’)2Alkalische Phosphatase1:5.000 – 1:50.0001:5.000 – 1:50.000
Gesamt IgG, F(ab’)2 und FabBiotin (mit Fluorophor-konjugierten Streptavidin)1:200 – 1:1.0001:200 – 1:1.000
Gesamt IgG und F(ab’)2Biotin (mit Enzym-konjugierten Streptavidin)1:20.000 – 1:40.0001:20.000 – 1:40.0001:500 – 1:5.0001:200 – 1:1.000

Streptavidin

ProduktKonjugatELISAWestern BlotHisto- / CytochemieDurchflusszytometrie
StreptavidinR-PE und APC1:50 – 1:200
StreptavidinPerCP1:25 – 1:100
StreptavidinHorseradish Peroxidase (HRP)1 – 2 µg/ml1 – 2 µg/ml ; 0,01 – 1 µg/ml (ECL)1 – 2 µg/ml
StreptavidinAlkalische Phosphatase1 – 2 µg/ml1 – 2 µg/ml ; 0,1 – 1 µg/ml (ECL)1 – 2 µg/ml
StreptavidinAlle Alexa Fluor, DyLight 405 und Cy30,5 – 2 µg/ml0,5 – 2 µg/ml
StreptavidinCy51 – 4 µg/ml1 – 4 µg/ml
StreptavidinAlle weiteren Fluorophore2 – 5 µg/ml2 – 5 µg/ml

Weitere Produkte

ProduktELISAWestern BlotHisto- / CytochemieDurchflusszytometrie
4nm Colloidal Gold-Antikörper Komplex1:20 – 1:200
6nm, 12 Colloidal Gold-Antikörper Komplex1:20 – 1:40
18nm Colloidal Gold-Antikörper Komplex1:10 – 1:20
Peroxidase-Anti-Peroxidase (PAP)1:5.000 – 1:50.0001:5.000 – 1:50.00025 – 50 µg/ml, 1:400 – 1:800
ChromPure10 µg/ml

Serum

Für die Blockierung von Hintergrundsignalen mit Normalseren empfehlen wir 5% v/v.

Anti-Kamelid Sekundärantikörper

Einzeldomänenantikörper aus Kameliden finden zunehmend Verwendung in immunologischen Methoden der Analytik, Diagnostik und Forschung. Um den steigenden Bedarf und damit die Produktion von VHH-Antikörpern zu unterstützen, bietet der amerikanische Hersteller Jackson ImmunoResearch drei neue Sekundärantikörper für die spezifische Detektion und Quantifikation von Kameliden-Immunglobulinen an. Diese Gesamt-IgG sowie IgG2 und IgG3 spezifischen Antikörper erlauben eine genaue Unterscheidung von IgG-Subklassen in kameliden Serum und ermöglichen damit eine optimierte Herstellung von Nanobodies aus Schwere-Ketten-Antikörpern.

Im Serum von Kameliden (Alpakas, Lamas, Kamele, Dromedare, Vikunjas und Guanakos) finden sich drei IgG-Subklassen (IgG1, IgG2 und IgG3). Erfahren Sie hier mehr über die Struktur der Subklassen.

Detektion von kameliden IgG-Subklassen im Western Blot

Anti-Alpaka IgG (H+L) und Anti-Alpaka IgG2+IgG3 von Jackson ImmunoResearch eignen sich für die Identifizierung von Alpaka IgG und Lama IgG. Abbildung 1 und 2 zeigen den spezifischen Nachweis von Alpaka und Lama IgG-Subklassen im Westen Blot.

IgG-Subklassen wurden aus Serum isoliert (Protokoll nach Mass et al., 2007) und durch SDS-Page unter nicht-reduzierenden Bedingungen aufgetrennt. Die Immunglobuline wurden anschließend auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern markiert (Verdünnung: 1: 20.000). Proteine wurden mit Chemilumineszenz Substrat nachgewiesen.

Alpaka IgG-Subklassen im Western Blot
Abbildung 1: Nachweis von Alpaka IgG-Subklassen im Western Blot. Folgende Sekundärantikörper wurden verwendet:
Blot A, Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L)-HRPO 128-035-003; Blot B, Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L)-HRPO [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] 128-035-160; Blot C, Ziege IgG anti-Alpaka IgG2+IgG3-HRPO [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] 128-035-229.
Lama IgG-Subklassen im Western Blot
Abbildung 2: Nachweis von Lama IgG-Subklassen im Western Blot. Folgende Sekundärantikörper wurden verwendet:
Blot D, Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L)-HRPO 128-035-003; Blot E, Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L)-HRPO [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] 128-035-160; Blot F, Ziege IgG anti-Alpaka IgG2+IgG3-HRPO [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] 128-035-229.

Zeitpunkt der Immunantwort optimal bestimmen

Für die Entwicklung von rekombinanten Nanobodies* werden Alpakas oder Lamas zunächst mit einem Antigen immunisiert. Eine anschließende Überwachung der Immunantwort ist nötig, um den idealen Zeitpunkt für die PBMC-isolation zu bestimmen.

Anti-Alpaka Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch ermöglichen Gesamt-IgG von Schwere-Ketten Antikörpern im Kameliden Serum zu unterscheiden. Da während einer Immunisierung die Antikörperantwort von IgG1, IgG2 und IgG3 nicht immer zeitgleich erfolgt, wird somit die Ausbeute an Schwere-Ketten-Antikörpern produzierenden PBMCs optimiert.

Die Serokonversion (Antigenspezifische Antikörper-Titer) kann mittels ELISA oder Durchflusszytometrie/ FACS (Pardon et al., 2014) bestimmt werden. Mit Jackson Anti-Alpaka IgG (H+L) Sekundärantikörpern kann die prä-Immun und post-Immun Phase der Serokonversion überwacht werden. Wie in Abbildung 3 dargestellt, kann die Generierung von Schwere-Kette Antikörpern jedoch nicht eindeutig mit Gesamt-IgG Antikörpern bestimmt werden. Jackson Anti-Alpaka IgG2+IgG3 sind ideal für die Messung von Schwere-Ketten Antikörper im Serum. Hiermit kann der optimale Zeitpunkt für die PBMC-Isolation bestimmt und dadurch die Ausbeute an potentiellen Antikörpern für die VHH-Bibliothek erhöht werden.

Nach der Immunisierung mit einem Antigen wurden ELISAs für die Charakterisierung der spezifischen Antikörperreaktion verwendet. ELISA Platten wurden hierfür mit dem Zielantigen gecoated, Antiserum diente als primäre Antikörperquelle und Peroxidase-konjugierte Sekundärantikörper 128-035-160 oder 128-035-229 wurden jeweils zur Bestimmung von Gesamt-IgG oder der IgG2- und IgG3-Subklassen verwendet.

Alpaka Immunisierung
Abbildung 3a: Antikörper 128-035-160 und 128-035-229 wurden für die Messung des antigenspezifischen Antikörper-Titer in Alpaka Serum während eines repräsentativen Immunisierung/ Booster Protokolls verwendet.

Prozentualer Vergleich zwischen IgG2 und IgG3 zu Gesamt IgG mittels ELISA
Abbildung 3b: Prozentsatz von IgG2 und IgG3 im Vergleich zu Gesamt-IgG im Serum. Analyse im ELISA.

Der Gesamt-IgG-Titer deutet auf einen idealen Isolierungszeitpunkt 150 Tagen nach Immunisierung, zu diesem Zeitpunkt ist die IgG2 und IgG3 Reaktion aber noch relativ schwach, erst 300 Tage nach Immunisierung ist der Titer optimal für eine PBMC-Isolation.

Wir haben 3 neue Spezifitäten in unserem Sortiment!

Anti-Alpaka IgG (H+L)

wdt_IDSekundärantikörperArt.-Nr.
1Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L) **128-005-003
2Ziege IgG anti-Alpaka IgG (H+L) [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] **128-005-160

Anti-Alpaka IgG2 + IgG3

Dieser Antikörper erkennt Alpaka und Lama IgG2- und IgG3-Subklassen in Serum und PBMCs, ohne Kreuzreaktion mit IgG1.

wdt_IDSekundärantikörperArt.-Nr.
1Ziege IgG anti-Alpaka IgG2+IgG3 [MinX Bo,Hu,Ms,Rb,Rt] **128-005-229

** Bitte beachten, diese Antikörper reagieren hauptsächlich mit der Fc Region. Sie sollten nicht für den Nachweis von VHH-Antikörpern eingesetzt werden. Hier finden Sie VHH-spezifische Antikörper und weitere Informationen.

Sekundärantikörper gegen Alpaka IgGs sind mit folgenden Konjugaten erhältlich:

• Unkonjugiert
• Horseradish Peroxidase
• Alkaline Phosphatase
• Biotin
• DyLight™ 405
• Alexa Fluor® 488
• Fluorescein (FITC)
• Cy™ 3
• R-Phycoerythrin
• Alexa Fluor® 594
• Rhodamine Red-X™
• Alexa Fluor® 647
• Cy™ 5

Literatur:

Für weitere Informationen über Antikörper aus Kameliden:

  • Arbabi-Ghahroudi, M. (2017). Camelid Single-Domain Antibodies: Historical Perspective and Future Outlook. Front. Immunol. 8, 1-8.
  • Daley, L.P., Gagliardo, L.F., Duffy, M.S., Smith, M.C., and Appleton, J.A. (2005). Application of Monoclonal Antibodies in Functional and Comparative Investigations of Heavy-Chain Immunoglobulins in New World Camelids. Clin. Diagn. Lab Immun. 12, 380-386.
  • Maass, D.R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., and Shoemaker, C.B. (2007). Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs). J. Immunol. 324, 13–25.
  • Pardon, E., Laeremans, T., Triest, S., Rasmussen, S.G.F., Wohlkönig, A., Ruf, A., Muyldermans, S., Hol, W.G.J., Kobilka, B.K., and Steyaert, J. (2014). A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nat. Protoc. 9, 674-693.
  • Wagner, H.J., Sehrle, S. Weiss, E. Cavallari, M., and Weber, W. (2018). A Two-Step Approach for the Design and Generation of Nanobodies. Int. J. Mol. Sci. 19, 1-16.

AffiniPure™ Antibodies is trademark of Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.
*Nanobody is a registered trademark of Ablynx N.V
DyLight™ fluorescent dyes is a trademark of Thermo Fisher Scientific.
Cy™ is a registered trademark of GE Healthcare.
Rhodamine Red™-X is a trademark of Invitrogen.
Alexa Fluor® is a trademark of Life Technologies Corp.
Images property Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.