Alkalische Phosphatase (ALP)

Alkalische Phosphatase (ALP) gehört zur Gruppe der Metalloenzyme und kommt in prokaryotischen sowie höheren eukaryotischen Zellen vor. Die Glycoproteine sind als dimere Moleküle aktiv und hydrolysieren Phosphorsäureester zu Alkohol und Phosphat. Hierfür wird neben metallischen Cofaktoren (Zn2+ und Mg2+) ein alkalisches Milieu (pH 9.8) benötigt, da ein Überschuss an freien Protonen die enzymatische Reaktion begrenzt.

ALP-Kristallstruktur-Jackson

Alkalische Phosphatase Kristallstruktur (Alk. Phos.) bei 2Å, 1ALK von PDB. Die Abbildung zeigt das Homodimer mit Phosphat-, Zink- und Magnesium-Ionen. (Abbildung: Jackson ImmunoResearch)

Verschiedene chromogene Substrate können durch ALP hydrolysiert und zu einem farbigen Präzipitat umgesetzt werden (siehe Tabelle). Damit eignet sich die Phosphatase als Reportermolekül in verschiedenen immunologischen Methoden. Alkalische Phosphatase-Konjugate für Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch, werden aus Kälberdarm isoliert und nach einem modifizierten Protokoll (Avremeas et al., 1978) aufbereitet. Diese Konjugate enthalten heterogene Komplexe mit relativ hohen Molekulargewicht (86 kDa), was eine Gewebepenetration für Antikörper erschwert. Damit sind ALP-konjugierte Sekundärantikörper weniger für die Immunhistochemie (IHC) geeignet als HRP-Konjugate.

ALP-konjugierte Sekundärantikörper

Die hochsensitive alkalische Phosphatase ist dafür ideal für Festphasen-Immunoassays wie ELISA oder Western Blot. Im Vergleich zu anderen Enzym-Konjugaten verläuft bei der alkalischen Phosphatase die Substrat-Umsetzungs-Reaktion linear, somit kann durch eine verlängerte Inkubationszeit die Sensitivität erhöht werden. ALP kann zudem eine Alternative für Gewebe mit einem hohen Level an endogenen Peroxidasen sein, da die Gefahr einer Substratbedingten unspezifischen Hintergrundfärbung gering ist.

Häufig eingesetzte Substrate:
SubstratProduktfarbe
5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) / nitro blue tetrazolium (NBT)dunkelblau-violett
Fast Redrot (intensivrot)
Neufuchsinrosarot (fuchsinrot)

Chromogene und Substrate finden Sie hier.

Literatur:

  • Jackson ImmunoResearch: Katalog 2019
  • Sharma, U., Pal, D. & Prasad, R. Alkaline Phosphatase: An Overview. Indian J Clin Biochem 29, 269–278 (2014).
  • Jackson ImmunoResearch: Chromogenic Detection for Western Blot, IHC, and ELISA (Jul 13 16)