Auswahl von Fluoreszenzfarbstoffen und -konjugaten

Die Auswahl der Fluorochrome für Immunfluoreszenzfärbungen ist abhängig von:

1. der Einstellung und der Ausstattung des Instrumentes, z.B. Verfügbarkeit von Lichtquellen, Filtersets und Detektionssystemen.

2. dem gewünschten Grad der Farbtrennung bei Mehrfachfluoreszenz-Markierungen: Rhodamin Red-X, Alexa Fluor 594 oder Alexa Fluor 647 geben beispielsweise eine bessere Trennung von Alexa Fluor 488 oder FITC als Cy3.

3. dem Expressiongrad des Antigens: für gering exprimierte Antigene ein leuchtintensiveres Fluorochrom als für stark exprimierte Antigene auswählen.

4. der erforderlichen Sensitivität. So sind Alexa Fluor 488, Cy3, Alexa Fluor 594 und Alexa Fluor 647 leuchtintensiver als FITC, Cy2, TRITC, Rhodamin-Red X, Texas Red und Cy5.

Bei der Wahl des Detektionssystems gibt es weitere Faktoren zu berücksichtigen:
Methode:
Zu beachten:

Mikroskopie

  • Penetration des Probenmaterials
  • Autofluoreszenz des Probenmaterials
  • pH-Bereich
  • Polares (wässriges) oder nicht-polares (plastisches) Eindeckmedium
  • Expressionslevel des Analyt ⇒ Verwenden Sie einen helleren Farbstoffe für schwach exprimierte Targets

Mikroskopie (Mehrfachfärbung)

  • Spektrale Überlappung von Fluorophoren
  • Verfügbare Filtersets (Mikroskop)
  • Expressionslevel des Analyt ⇒ Verwenden Sie einen helleren Farbstoffe für schwach exprimierte Targets

Super-Resolution Mikroskopie (STORM und STED)

  • Hohe Emission durch STED-Laser erzielt hohe Sättigung
  • Helligkeit
  • Photoswitch
  • Fotostabilität

Durchflusszytometrie

  • Größere und hellere Fluoreszenzproteine wie R-PE, APC, PerCP oder die Brilliant Violet Konjugate, eignen sich für die Markierung von Oberflächenproteinen.
  • Kleinere Fluoreszenzfarbstoffe können sowohl für die Detektion von Oberflächenproteinen als auch für intrazelluläre Färbungen eingesetzt werden.

Western Blot und Dot Blot

  • Tief-/Infrarot Fluoreszenzfarbstoffe für hohe Sensitivität
  • Spektrale Überlappung
Verfügbare Fluorochrome für die Histo-/Cytochemie und Durchflusszytometrie
FluorochomAmax [nm]Emax [nm]FarbeAntikörper-Verdünnung
DyLight 350DyLight 350353432Blau-Violett1:100 - 1:800
DyLight 405DyLight 405400421Blau-Violett1:100 - 1:800
BV 421Brilliant Violet 421407421Blau-Violett1:50 - 1:200
AMCAAminomethylcoumarin-Acetat350450Blau1:50 - 1:200
BV 480Brilliant Violet 480436478Blau1:50 - 1:200
Cy2Carbocyanin492510Grün1:50 - 1:200
DyLight 488DyLight 488493518Grün1:100 - 1:800
IFKine™ GreenIFKine™ Green493518Grün1:50 - 1:1000
Alexa 488Alexa Fluor 488493519Grün1:100 - 1:800
FITCFluorescein (-Isothiocyanat)492520Grün1:50 - 1:200
Cy3Indocarbocyanin550570Gelb1:100 - 1:800
IFKine™ OrangeIFKine™ Orange555570Gelb1:50 - 1:1000
TRITCTetramethylrhodamin550576Gelb1:50 - 1:200
DyLight 550DyLight 550562576Gelb1:100 1:800
R-PER-Phycoerythrin490/545/566580Orange-Rot1:50 - 1:200
RRXRhodamin Red X570590Orange-Rot1:50 - 1:200
Alexa 594Alexa Fluor 594591614Rot1:100 - 1:800
IFKine™ RedIFKine™ Red591615Rot1:50 - 1:1000
DyLight 594DyLight 594593618Rot1:100 - 1:800
Texas RedTexas Red596620Rot1:50 - 1:200
DyLight 633DyLight 633638658Rot1:100 - 1:800
APCAllophycocyanin650660Tief-/Infrarot1:50 - 1:200
Alexa 647Alexa Fluor 647651667Tief-/Infrarot1:100 - 1:800
Cy5Indodicarbocyanin650670Tief-/Infrarot1:100 - 1:800
PerCPPeridinin-Chlorophyll482676Tief-/Infrarot1:50 - 1:200
Alexa 680Alexa Fluor 680684702Tief-/Infrarot1:100 - 1:800
DyLight 680DyLight 680692712Tief-/Infrarot1:100 - 1:800
DyLight 800DyLight 800777794Infrarot1:100 - 1:800
Alexa 790Alexa Fluor 790792803Infrarot1:100 - 1:800

Die früher erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffe Cy2 und DyLight 488 bzw. Cy5 und DyLight 647 sind durch die Farbstoffe Alexa 488 bzw. Alexa 647 ersetzt worden, ebenso wie DyLight 594 durch Alexa 594. Im orangen Emissionsbereich sind die fluoreszenzstarken Cy3-Konjugate von Jackson ImmunoResearch erhältlich. DyLight-Konjugate sind jetzt von unserem Partner ImmunoReagents erhältlich.

Beispielprotokoll 3-fach Markierung

Schwerpunkt Fluoreszenzfarbstoffe

Optimales Eindecken für mehr Fluoreszenzstablität und Signalschärfe

Um Ausbleichen zu verhindern und die Signalstärke zu erhalten, eignet sich für Mehrfachmarkierungen mit allen Fluoreszenzfarbstoffen als universelles Eindeckmedium ImmunoSelect® Antifading Mounting Medium. Die Zusammensetzung des Mediums verhindert das häufige Problem der Autofluoreszenz von Eindeckmedien. Durch eine starke Anfangsfluoreszenz, kombiniert mit sehr guten Antifading-Eigenschaften und keinerlei Autofluoreszenz in den relevanten Spektralbereichen garantiert ImmunoSelect® Antifading Mounting Medium klare Signale mit hoher Kontrastschärfe.

Mounting Medium für Fluoreszenzkonjugate mit DAPI

Keine Materialverluste bei Färbung seltener Zell- und Gewebeproben

Wirkungsvolles Immobilisieren von Zell- und Gewebeproben beugt Verlusten wertvollen Probenmaterials durch Wasch- und Färbeschritte vor. Immunoselect® Adhäsionsobjektträger ermöglichen schnelle und starke Haftung von Proben durch einfaches Auftropfen ohne zusätzliche Zentrifugation, Trocknung oder Fixierung. Die neuartige Haftbeschichtung der Objektträger reagiert mit den natürlichen Oberflächenstrukturen von Zellen und Geweben und verankert diese über verschiedene Bindungsprinzipien dauerhaft auf der Glasoberfläche. ImmunoSelect Adhäsionsobjektträger verhindern ein Abschwemmen von Proben unter extremsten Inkubationen bei vollem Erhalt der Antigenität.

Adhesive Slides für die Mikroskopie
  • Blitzschnelles Anheften von Zellen und Gewebeschnitten mit hohen Ausbeuten > 95%
  • Neuartige Alternative zu Polylysin und anderen Adhäsionsverfahren
  • Keine Cytospins oder Ausstriche notwendig, Zellen auftropfen und absinken lassen
  • Zelladhäsion resistent gegen Hitze, Färbungen und Denaturierung
  • Kein Zellverlust selbst bei harschen zytologischen Färbetechniken
  • Überragender Erhalt der Zell- und Gewebemorphologie

Fluoreszenzkonjugate der Sekundärantikörper

Alle Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch Labs werden immunaffinitätschromatographisch durch Adsorption an agarosegekoppelte Antigene aus Antiseren isoliert. Das patentierte sequentielle Elutionsverfahren (AffiniPure) von Jackson ImmunoResearch Labs sorgt für eine schonende Ablösung der Antikörper vom Antigen, woraus Antikörper mit idealen Bindungseigenschaften resultieren.

Weitere Festphasenadsorptionen an Serumproteine verschiedenster Spezies sowie an IgG, IgM, IgA und IgG-Fragmente eliminieren Kreuzreaktionen und stellen die Ig-spezifische Reaktivität der Sekundärantikörper sicher.

Die Nachweisintensität jedes Fluorochrom-Antikörper-Konjugats hängt außer von den Bindungseigenschaften des Antikörpers von der Helligkeit und Fotostabilität des Farbstoffs sowie dem optimalen Verhältnis von Farbstoffmolekülen pro Antikörper ab. Für die Herstellung von Fluoreszenzkonjugaten mit bestmöglicher Nachweisstärke und minimalem Hintergrund werden daher für jeden Farbstoff molare Sättigungskurven vs. Fluoreszenzintensität, Antikörperaktivität, Hintergrundfärbung u. a. Parametern erstellt und anhand dieser Daten eine optimale Farbstoffkopplung ermöglicht.

Die Fluoreszenzkonjugate von Jackson ImmunoResearch Labs werden gefriergetrocknet in 0,01 M Natriumphosphat / 0,25 M NaCl pH 7,6 mit 15 mg/ml BSA / 0,05 % Natriumazid geliefert. Vor erstmaligem Gebrauch Fluoreszenzkonjugat gemäß Datenblattangaben in Aqua dest. auflösen.

Alexa Fluor®, Rhodamin RedTM-X und Texas Red® sind eingetragene Marken von Life Technologies, Inc.*. Cy™ ist eine Marke von GE Healthcare (Patent 5.268.486). Brilliant Violet™ ist ein Markenzeichen von Sirigen Inc., a Becton, Dickinson and Company affiliate. DyLight™ ist ein Markenzeichen von Thermo Fisher Scientific. Über alle Farbstoffe und deren Farbstoffprodukte besitzt Jackson ImmunoResearch Labs mit den genannten Firmen Lizenzvereinbarungen zu den Farbstoff-Technologien bezüglich Verwendung, Herstellung, Handel und Verkauf.
* Konjugate dieser Farbstoffe sind nicht zur Verwendung für kommerzielle Zwecke (Weiterherstellung, Diagnostik, Therapie, Auftragsbestimmung o. a.) bestimmt. Für Lizenz-Informationen zur Verwendung für andere Zwecke als der Forschung: Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA 92008.