FabuLight™-Antikörper sind Fab-Fragment Sekundärnatikörper, die spezifisch für die Fc-Region von IgG- oder IgM-Primärantikörpern sind.
FabuLight™ von Jackson ImmunoResearch sind mit 9 verschiedenen Fluorophoren oder als Biotin-Konjugate erhältlich und ermöglichen die Markierung von Primärantikörpern vor der Inkubation mit Zellen oder Gewebe. Dies bietet eine zeitsparende Alternative zu sequenziellen Inkubationsverfahren in der Durchflusszytometrie und Immunhistochemie, ohne die aktive Stelle des primären Antikörpers zu beeinträchtigen.
FabuLights können zur Markierung von Fc-Domänen von Fusionsproteinen oder Zelloberflächen-Immunglobulinen verwendet werden, ohne Zellen zu vernetzen oder zu aktivieren.
FabuLights werden nicht gegen andere Spezies kreuzadsorbiert, so dass Blockierungsschritte erforderlich sein können, um die Markierung endogener Immunglobuline zu vermeiden. Hinweise zur Erstellung von Protokollen finden Sie im umseitigen Beispielprotokoll.
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Zeitersparnis und Schonung der Zellen durch Reduzierung der Inkubations- und Waschschritte
Die Inkubation mit FabuLight-markierten primären Antikörpern erfordert weniger Waschvorgänge als die sequentielle Inkubation mit primären Antikörpern und markierten sekundären Antikörpern, wodurch die Schädigung von Zellen in Durchflusszytometrieprotokollen verringert wird. Auch die Inkubationsschritte in Protokollen, die mehrere Primärantikörper aus derselben Wirtsspezies erfordern, werden reduziert.
Keine Interferenz mit der aktiven Stelle des primären Antikörpers
Der resultierende Komplex aus primärem Antikörper und FabuLight fällt nicht aus und aggregiert nicht, da die mit dem Farbstoff konjugierten Fab-Anti-Fc-Fragmente des sekundären Antikörpers monovalent sind. FabuLight-Primärantikörper-Komplexe bieten eine gute Gewebepenetration und eine geringe unspezifische Bindung.
Technische Tipps zur Anwendung von FabuLight™ von Jackson ImmunoResearch
Optimale Protokolle für jede Anwendung müssen empirisch ermittelt werden
- FabuLight-Antikörper wurden nicht adsorbiert, um Kreuzreaktivitäten mit anderen Spezies auszuschließen. Daher kann es erforderlich sein, endogenes IgG vor der Inkubation mit einem unmarkierten FabuLight zu blockieren, bevor ein mit FabuLight markierter Komplex aufgetragen wird.
- FabuLight-markierte Komplexe liefern kein so helles Signal wie die sequentielle Inkubation mit einem primären Antikörper und die anschließende Inkubation mit einem markierten sekundären Antikörper.
- Um eine Verdrängung des FabuLight-Primärantikörpers durch einen nachfolgenden markierten Sekundärantikörper zu vermeiden, kann eine leichte Quervernetzung mit Glutaraldehyd erforderlich sein, vorausgesetzt, sie beeinträchtigt nicht die Antigenität der nachfolgenden Zielproteine.Bei allen Mehrfachmarkierungsanwendungen empfehlen wir, die FabuLights nacheinander zu inkubieren, um die Kreuzreaktivität zu minimieren.
- Markieren Sie das weniger häufig vorkommende Zielantigen zuerst, um beste Ergebnisse zu erzielen.
- Bei primären Antikörpern der IgG-Klasse führt die Komplexierung bei einem Molverhältnis von 3:1 von FabuLight-Primärantikörper (gleiche Gewichtsverhältnisse) zu einem guten Grad der Markierung des primären Antikörpers ohne übermäßige Mengen an ungebundenem FabuLight.
- Für IgM-Primärantikörper verwenden Sie ein Molverhältnis von 15:1 von FabuLight-Primärantikörper (gleiches Gewichtsverhältnis).
- Titrieren Sie mit FabuLight markierte Komplexe im Verhältnis zu ihren Zielantigenen, um die Menge an freiem Fab-Anti-Fc zu minimieren und so eine mögliche Fehlmarkierung bei einer Mehrfachmarkierungsanwendung zu vermeiden.