Horseradish Peroxidase (HRP)

Horseradish Peroxidase (HRP, deutsch: Meerrettichperoxidase) gehört zur Gruppe der Metalloenzym und wird industriell aus der Wurzel des Meerrettichs (Armoracia rusticana) gewonnen. Für die Herstellung von HRP-konjugierten Sekundärantikörpern nutzt Jackson ImmunoResearch ein modifiziertes Protokoll nach Nakane und Kawaoi (1974). Die relativ kleine Meerrettich-Peroxidase (40 kDa) wird als Reportermolekül in verschiedenen immunologischen Methoden (Western Blot, ELISA, Immunhistochemie) eingesetzt und wird in der Regel im Verhältnis von 4:1 an Sekundärantikörper gekoppelt. Die geringe Größe des HRP-Konjugat erlaubt eine einfache Gewebepenetration, weswegen HRP eines der meistgenutzten Enzyme für den Einsatz in der Immunhistochemie (IHC) auf auf Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebe ist.

HRP-konjugierte Sekundärantikörper

Horseradish Peroxidasen besitzen eine Häm-Gruppe mit einem katalytischen Eisen-III-Ion innerhalb des Porphyrinringes sowie zwei Calcium-Atome (Ca2+). In der durch die Peroxidase katalysierten Redoxreaktion können verschiedene Substrate umgesetzt werden, mittels fluoreszenter oder farbiger Reaktionsprodukte (siehe Tabelle) werden Antigene leicht sichtbar gemacht.

Western Blot 115-035-003 Jackson ImmunoResearch
Schwere- (HC 50kDa) und leichte-Kette (LC 25kDa) eines reduzierten und SDS-denaturierten Maus IgG. Ziege IgG anti-Maus IgG (H+L)-HRP und TMB Substrat wurden für die Visualisierung im Western Blot verwendet. (Abbildung: Jackson ImmunoResearch)
HRP-Kristallstruktur-Jackson
Kristallstruktur der Meerrettichperoxidase bei 1.57A von PDB 1HCH. Die Abbildung zeigt zwei Calcium Moleküle (graue Kugeln) und das katalytische Eisen-Ion (orangene Kugel) innerhalb des Porphyrinringes. (Abbildung: Jackson ImmunoResearch)

Häufig eingesetzte Substrate:

SubstratProduktfarbe
DAB (3,3′-Diaminobenzidin)braun
AEC (3-Amino-9-ethylcarbazol)rotbraun
TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin)dunkelblau

Chromogene und Substrate finden Sie hier.

Wichtige Informationen:

Endogene Peroxidasen

Manche Gewebe enthalten endogene, Peroxidase-ähnliche Proteine, welche mit dem Substrat für die Peroxidase reagieren können. Hierdurch kann es zu einer unspezifischen Hintergrundfärbung kommen. Für diese Fälle empfehlen wir das Gewebe vor der Färbung mit Wasserstoffperoxid (H2O2) zu behandeln, um die endogenen Peroxidasen zu sättigen und ein klares Signal zu erhalten.

Reagenzien Kompatibilität

  1. Eine Zugabe von Sodium Azide zu Lösungen mit HRP-Konjugaten kann die Enzymaktivität der Meerrettichperoxidase inaktivieren.
  2. Glycerol kann die Aktivität von Peroxidasen inhibieren. Wenn Glycerol zu Lösungen mit HRP-Konjugaten hinzugefügt wird, um die Haltbarkeit zu erhöhen, dann sollte nur hochreines Glycerol verwendet werden. Mehr Informationen über die Lagerung von Sekundärantikörpern erhalten Sie in unserem FAQ.

Literatur:

  • Jackson ImmunoResearch: Katalog 2019
  • Veitch, N. C. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme. Phytochemistry 65, 249–259 (2004).
  • Jackson ImmunoResearch: Chromogenic Detection for Western Blot, IHC, and ELISA (Jul 13 16)