Was soll ein Sekundärantikörper erkennen? Beispiele zur Immunisierung und der sich ergebenden Spezifität (Erkennung)
Für immunologische Assays werden größtenteils polyklonale Antikörper vom Typ IgG (z. B. aus Kaninchen, Ziege, Huhn etc.) oder monoklonale Antikörper aus Maus, Ratte oder auch Hamster, die aus B-cell Hybridomen gewonnen werden, eingesetzt. Sekundärantikörper sollen dabei eine möglichst hohe Sensitivität für diesen Primärantikörper haben.
In der Regel ist dies ein Sekundärantikörper, für dessen Gewinnung als Immunogen ein Gesamtmolekül IgG(H+L) eingesetzt wurde. Dieser erkennt eine Vielzahl von Epitopen auf Antikörpern verschiedener Klassen und Subklassen. (s. Abbildung Antikörperaufbau). In den Beispiele unten wird diese Kreuzreaktivität Anhand von 3 Beispielen und den daraus resultierenden Spezifiäten (Erkennungen) erläutert.
Soll in einem geplanten Assay nur ein Primärantikörper erkannt werden und sind Immunglobuline anderer Klassen oder Subklassen kein Störfaktor, wie dies in den meisten Anwendungen der Fall ist, ist die Spezifität IgG (H+L) normalerweise am besten geeignet.
Häufig sollen in einem Experiment mehrere Primärantikörper aus unterschiedlichen Spezies gleichzeitig nachgewiesen werden (Mehrfachmarkierungen). In diesem Fall muss eine kreuzweise Erkennung verhindert werden. Dies geschieht über die Adsorption von Antikörpern gegen Immunglobuline von anderen Spezies. Die optimale Spezifität für jeden der Sekundärantikörper ist dann immer noch IgG(H+L).
IgG als Referenzstrukur für Immunglobuline
Ein Immunglobulin G (IgG) besteht aus je zwei identischen leichten („L“ight) bzw. schweren („H“eavy) Polypeptidketten, die durch kovalente Disulfidbrücken verbunden sind. Der untere Bereich wird als Fc-Fragment (fragment crystallizable) bezeichnet. Die beiden Arme, die jeweils aus dem oberen Teil der H-Kette und einer L-Kette gebildet werden, heißen Fab-Fragment (antigen binding fragment). Die leichten Ketten bestehen aus jeweils einer variablen (VL) und einer konstanten Domäne (CL). Die schweren Ketten hingegen haben jeweils eine variable und drei konstante Domänen. Bezeichnet werden diese analog als VH und CH1, CH2, CH3.
Beispiel der Herstellung eines Antikörpers der Spezifität IgG (H+L) der Maus
Die Tierspezies (z.B. Ziege), in der das Antiserum gewonnen werden soll („Wirt“), wird mit aufgereinigtem Immunglobulin IgG(H+L) der Maus immunisiert. In der Regel werden die Immunglobuline, die zur Immunisierung verwendet werden, aus Gesamtserum gewonnen, dh. die Zusammensetzung der einzelnen Subklassen und Teile entspricht der Normalverteilung im Serum der Spezies.
Antiserum der mit IgG(H+L) immunisierten Ziege enthält Antikörper, die sowohl gegen die leichte als auch gegen die schwere Kette des IgG-Moleküls gerichtet sind. Dieses Antiserum reagiert sowohl mit den F(ab‘)2-Anteilen als auch mit dem Fc-Anteil des IgG. Anti-IgG reagiert deshalb auch sehr gut mit anderen Immunglobulinklassen (IgM, IgA, IgE), da diese dieselben leichten Ketten (κ und λ) haben. Der anti-IgG (H+L) Antikörper, der nicht präadsorbiert sind besitzen ca. 40% – 60% Reaktivität mit leichten Ketten. Bei hoch adsorbierten anti-IgG (H+L) Antikörpern kann diese wesentlich geringer ausfallen.
Beispiel der Herstellung eines Antikörpers der Spezifität IgG (Fc) des Menschen
Die Immunisierung (z.B. der Ziege) mit aufgereinigtem IgG Fc-Fragment (z.B. aus dem Menschen) führt zu Antikörpern, die hochspezifisch die schwere Kette des IgG-Moleküls detektieren. Da die Unterschiede der verschiedenen Immunglobulinklassen im Bereich der schweren Kette liegen, lassen sich hier sehr gut IgG, nicht aber IgM, IgA und IgE nachweisen. Diese Fc-Fragment-spezifischen Antikörper werden häufig zusätzlich gegen F(ab‘)2-Fragmente präadsorbiert. In einigen Fällen wird zudem eine mögliche Kreuzreaktion gegen IgM und IgA (anti-Human) oder nur gegen IgM (anti-Maus, anti-Ratte) durch weitere Präadsorption(en) minimiert. Diese Antikörper (anti-Human, anti-Maus, anti-Ratte) sind durch „Fcγ“ gekennzeichnet. Sie weisen weniger als 1% Restaktivität gegen leichte Ketten oder IgM bzw. IgA auf.
Anti-IgG (Fc) Antikörper reagieren nicht mit allen IgG-Subklassen gleich gut wie anti-IgG, F(ab‘)2-Fragment-spezifische Antikörper. Wegen des geringen Prozentsatzes an Antikörpern gegen die seltenen IgG-Subklassen (IgG3 und IgG4) sollten zum Nachweis dieser Subklassen deshalb besser anti-IgG (H+L) oder anti-IgG F(ab‘)2-Antiseren verwendet werden.
Beispiel der Herstellung eines Antikörpers der Spezifität IgG F(ab‘)2-Fragment des Menschen
Diese Antikörper werden durch Immunisierung mit aufgereinigtem F(ab‘)2-Fragment des Gesamt-IgG gewonnen. Da der Anteil an schwerer Kette des F(ab‘)2-Fragments nur sehr schwach immunogen wirkt, erhält man auf diese Weise Antikörper, die, abhängig vom Grad ihrer Präadsorption, zu mehr als 60% gegen die leichte Kette gerichtet sind. Anti-F(ab‘)2-Fragment Antikörper werden zusätzlich häufig gegen IgG Fc-Fragment präadsorbiert und reagieren deshalb nur mit dem Fab-Teil des IgG.
Mit diesen Immunreagenzien lassen sich alle lg-Klassen und Subklassen (IgM, IgG1-4, IgA, etc.) relativ gleichmäßig nachweisen. Diese Antikörper sind also optimal geeignet, wenn alle Ig-Klassen unabhängig von der Subklasse nachgewiesen werden sollen oder wenn nicht sicher ist, welcher Klasse der Primärantikörper angehört.
Da das jeweilige Antiserum (z.B. aus der Ziege) überwiegend gegen leichte Ketten des κ-Typs gerichtet ist, ist die Sensitivität von anti-F(ab‘)2-Fragment Antikörpern bei der Erkennung von Primärantikörpern, die leichte Ketten vom λ-Typ tragen, eingeschränkt
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