Probenmaterial vorbereiten: Paraffinschnitte hydrieren und Antigendemaskierung nach Herstellerangaben für den Primärantikörper durchführen, Gefrierschnitte fixieren und in Puffer waschen, Zellen in Puffer waschen, fixieren und nochmals waschen.
Waschen: 2 x 5 Minuten mit TBS.
- Optional: Gewebeschnitte durch Inkubation mit 1% TX-100 in TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur vorreinigen.
- Beseitigung endogener Peroxidaseaktivität in 0,6% H2O2 in TBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Hinweis: alternativ gebrauchsfertige Peroxidase-Blockierungslösung von dianova verwenden (ACA500(IVD), ACA999(IVD)). - Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
- Blockierung mit Normalserum: Inkubation der Zellen / Schnitte mit 5% Normalserum in TBS (+ 0,3% TX-100) für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindungsstellen für nachfolgend eingesetzten Antikörper zu blockieren.
Hinweis: Normalserum aus derselben Spezies wie die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers (z. B. Ziegenserum, Kat.-Nr. 005-000-121). - Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
- Blockierung endogener Maus-Immunglobuline: Zellen / Schnitte mit 20µg – 100 µg/ml unkonjugierten Fab-Fragmenten anti-Maus IgG (H+L) in TBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: 1. Fab-Fragmente aus derselben Spezies wie die Wirtsspezies des Sekundärantikörpers (z. B. Fab Ziege anti-Maus IgG (H+L), Kat.-Nr. 115-007-003). 2. Die Blockierungseffizienz kann über die Konzentration der Fab-Fragmente und über die Inkubationszeit (2 Stunden bei Raumtemperatur oder Übernachtinkubation bei 4°C) erhöht werden. - Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
- Primärantikörper-Inkubation: Zellen / Schnitte mit nach Herstellerangaben verdünntem Maus-Primärantikörper für 30 – 60 min bei Raumtemperatur inkubieren. Verdünnung in TBS/1%BSA oder in Normalserum-Blockierungslösung (5.).
- Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
- Sekundärantikörper-Inkubation: Zellen / Gewebeschnitte mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper in TBS entsprechend Verdünnungsempfehlung des Herstellers (ca. 0,2 – 2 µg/ml) für 30 – 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren (z. B. Ziege anti-Maus IgG (H+L), Kat.-Nr. 115-035-062, 115-035-146, 115-035-166).
- Waschen: 3 x 5 Minuten mit TBS.
- Substrat-Inkubation: für 3 – 7 Minuten in der Substratlösung (z. B. DAB) bei Raumtemperatur inkubieren (Kat.-Nr. ACH500 (IVD), ACT500(High Contrast, IVD).
- In Leitungswasser spülen.
- Mit Hämatoxylin gegenfärben, falls erwünscht (Kat.-Nr. HAQ500).
- In destilliertem Wasser 3 x 5 Minuten spülen.
- Lufttrocknen lassen und mit permanentem Eindeckmedium eindecken (Kat.-Nr. PMT030).
Hinweise:
- Statt TBS als Puffer für Blockierungs-, Wasch- und Antikörperverdünnungslösung kann auch PBS eingesetzt werden. TBS kann für einen geringeren Hintergrund vorteilhafter sein als PBS.
- Eine Hintergrundfärbung von Probenmaterial kann nicht nur eine Ursache haben. So können u. a. auch endogene Peroxidase-Aktivität im Probengewebe oder Fc-Rezeptoren einen Einfluss haben. Peroxidase-Aktivität wird durch einen Blockierungsschritt vor der Blockierung mit Normalserum oder nach der Primärantikörperinkubation inhibiert. Die Bindung des Sekundärantikörpers an Fc-Rezeptoren von Zellen und Geweben lässt sich einerseits durch eine geeignete Blockierung mit Normalserum oder speziellen Fc-Rezeptor-Blockierungslösungen verhindern, andererseits durch die Verwendung von F(ab’)2-Fragment-Sekundärantikörpern (z. B. in Schritt 11. F(ab’)2 Ziege anti-Maus IgG(H+L), Kat.-Nr. 115-036-062).