Western Blot Troubleshooting Guide

Problem

Analyt wird nicht detektiert.

Lösung / Ursachen

• Überprüfen Sie die eingesetzte Proteinmenge: Bradford-Test; BCA-Methode
• Erhöhen Sie die Proteinkonzentration
• Verwenden Sie, wenn möglich, eine Positivkontrolle, in der das Antigen hoch exprimiert ist.
• Verwenden Sie einen frischen LysepufferGeben Sie einen Protease-Inhibitor zum Probenpuffer
• Lagern Sie Ihre Proben auf Eis (4°C)

Analyt läuft während der Elektrophorese aus dem Gel.

• Stellen Sie anhand des Größenmarker sicher, dass das gewünschte Protein (kDa) noch im Gel vorhanden ist.
• Reduzieren Sie die Dauer der Gelelektrophorese

Kein Transfer vom Trenngel auf Membran

• Überprüfen Sie, ob ein Transfer vom Gel auf die Membran erfolgt ist: Ponceau S Staining
• Stellen Sie anhand einer Ladekontrolle (Housekeeping) sicher, dass der Transfer gleichmäßig erfolgt ist.

Falsche Transfermembran verwendet

PVDF

• Eine PVDF Membran muss vor Gebrauch mit Methanol aktiviert werden.
• Höhere Bindeeigenschaften (170 bis 200 μg/cm2)
• Kann zu mehr Hintergrund führen als bei einer Nitrocellulose Membran
• Ist geeignet für das Verwenden von Stripping-Puffern und anschließender Inkubation mit neuen Antikörpern („reprobing“)

Nitrocelluse

• Geringe Bindeeigenschaften (80 bis 100 μg/cm2)
• Weniger Hintergrund

Wählen Sie die richtige Porengröße für Ihr Analyt:

• 0.1, 0.2 oder 0.45μm. (0,45μm eignet sich für die meisten Anwendungen (≥ 20kDa))

Transferbedingungen

• Während des Transfers muss ein luftblasenfreier Kontakt zwischen Membran und Gel bestehen.
• Verringern Sie die Transferzeit oder Spannung („Over transfer“).

Dauer der Blockierung

Reduzieren Sie die Inkubationszeit

• 1h bei Raumtemperatur

Wahl des Blockierungsreagenz

Antigen Maskierung

• Verwenden Sie eine niedrigere Konzentration
• Verwenden Sie einen anderen Puffer

Wir empfehlen für das Blockieren 5% Normalserum aus der Spezies zu verwenden, aus der der Sekundärantikörper stammt. Alternativ IgG-freies BSA.

Zu starkes waschen

• Verringern Sie die Zeit und Anzahl der Waschschritte
• 3x 5 Min (RT)
• Verringern Sie die Konzentration an Detergenz
• 0.1-0.5% Tween 20

Falscher Primärantikörper

Stellen Sie sicher, dass der Primärantikörper für Western Blot geeignet ist (Datenblatt)

Inkubationszeit (Primärantikörper)

Verlängern Sie die Inkubationszeit

• Über Nacht bei 4°C

Antikörperkonzentration zu niedrig

• Überprüfen Sie die verwendete Antikörperkonzentration.
• Überprüfen Sie die Affinität
• Setzen Sie zunächst eine höhere Konzentration ein als im Datenblatt angegeben. Anschließend wird die Konzentration schrittweise verringert.

Falscher Sekundärantikörper

Prüfen Sie, ob der eingesetzte Sekundärantikörper den verwendeten Primärantikörper binden kann (Datenblatt)

Sekundärantikörper-Konjugat (HRP) beeinträchtigt

• Verwenden Sie kein Sodium Azide im Puffer. Dieses inhibiert die Reaktion des HRP (Horseradish peroxidase)-Konjugates.
• Verwenden Sie kein Glycerol mit einem ACS grad von unter 99,5%. Dieses inhibiert die Reaktion des HRP (Horseradish peroxidase)-Konjugates.
• Vermeiden Sie wiederholtes Auftauen oder Einfrieren Ihrer Sekundärantikörper.
• Antikörperlösungen sollten aliquotiert werden

Tipps zur Lagerung von Antikörpern

ECL Reagenz abgelaufen

Verwenden Sie eine neue ECL Reagenz

ECL Reagenz kontaminiert

Verwenden Sie eine neue ECL Reagenz

Belichtungszeit

• Abhängig von dem Antigenexpressionslevel, kann die notwendige Belichtungszeit variieren.
• Erhöhen Sie in kleinen Schritten die Belichtungszeit

Problem

Lösung / Ursachen

Hohe Antigen-Expression

Verringern Sie die Proteinkonzentration

Wahl des Blockierungsreagenz

• Milchpulver ist nicht geeignet, wenn phosphorylierte Proteine detektiert werden sollen.
• Der Primärantikörper kann mit dem enthaltenen Casein kreuzreagieren.
• Milchpulver ist nicht geeignet, wenn Strepavidin/Avidin Konjugate verwendet werden.
• Milch enthält endogenes BiotinBSA und Milchpulver sind nicht geeignet, wenn Anti-Ziege/ Rind oder Schaf Sekundärantikörper verwendet werden.
• BSA und Milch können Immunglobuline aus dem Rind enthalten, womit die o.g. Sekundärantikörper kreuzreagieren.

Wir empfehlen für das Blockieren 5% Normalserum aus der Spezies zu verwenden, aus der der Sekundärantikörper stammt. Alternativ IgG-freies BSA.

Inkubationszeit (Blockierungsreagenz)

Erhöhen Sie die Inkubationszeit

• 1h bei Raumtemperatur

Falsche Konzentration des Primärantikörper

• Verringern Sie die Konzentration des Primärantikörpers
• Verdünnungsreihe

Falsche Konzentration des Sekundärantikörper

• Verringern Sie die Konzentration des Sekundärantikörpers
• Verdünnungsreihe

Belichtungszeit

Reduzieren Sie schrittweise die Belichtungszeit.

Transfermembran

• Verwenden Sie Pinzetten für die Membran
• Lassen Sie die Membran nicht austrockenen

Detektionsreagenz

Reduzieren Sie die Substratkonzentration

Problem

Lösung / Ursachen

Protein ist degradiert

• Verwenden Sie ein frisches Lysat
• Lagern Sie Ihre Proben auf Eis (4°C)
• Geben Sie einen Protease Inhibitor zum Probenpuffer

Zustand der Probe

• Andere Isoform wird detektiert
• Posttranslationale Modifikation
• Einfluss auf Molekulargewicht, mögliche Entstehung von Doppelbanden
• Verwenden Sie, wenn möglich, eine negative Kontrolle
• Verwenden Sie, wenn möglich, eine positiv Kontrolle
• Bakterielle Kontamination der Probe/ im Puffer
• Verwenden Sie deionisiertes Wasser

Transfermembran

• Entfernen Sie vor dem Transfer alle Luftblasen zwischen Gel und Membran.
• Waschen Sie die Membran kurz nach dem Transfer, vor dem Blocken, um mögliche Reste von Gel und/oder SDS-Partikel zu entfernen.

Primärantikörper

• Prüfen Sie, ob der Primärantikörper spezifisch bindet.
• Verwenden Sie in einer Kontrolle nur den Sekundärantikörper, ohne Primärantikörper.
• Optimieren Sie die Antikörperkonzentration