Anti-Hapten-Systeme können sehr gut in Mehrfachmarkierungen mit haptenylierten Primärantikörpern eingesetzt werden (Abb. 1). Besonders dann, wenn sich Primärantikörper nicht mit Spezies- oder Subklassen-spezifischen Sekundärantikörper-Konjugaten unterscheiden lassen, garantieren sie eine empfindliche und differenzierte Darstellung der Antigene.
Fluorescein-anti-Fluorescein-Markierungen
Anti-Fluorescein Antikörper bilden neben ihrer besonderen Eignung für Mehrfachmarkierungen eine hervorragende Grundlage für die nachfolgende Signalverstärkung durch Markerenzyme, Fluoreszenz- und Immungold-Markierungen. Ein wesentlicher Vorteil von Fluorescein-anti-Fluorescein Techniken gegenüber anderen Hapten-anti-Hapten-Verfahren sowie (Strept)Avidin-Methoden besteht darin, dass Hapten-Signale detektiert werden können oder ihre Konzentration durch Absorption in Lösung messbar ist, bevor der sekundäre Nachweisschritt folgt. Außerdem kann durch ein auf Fluorescein-anti-Fluorescein basiertes Nachweissystem unerwünschte Hintergrundfärbung zelleigenen Biotins umgangen werden.
Peroxidase-markierte Antikörper gegen Fluorescein erlauben die Umwandlung des Fluoreszenz-Signals Fluorescein-konjugierter Nachweisreagenzien in ein lichtmikroskopisch sichtbares und elektronendichtes Reaktionsprodukt (Abb. 2). Der Einsatz dieser Konjugate steigert die Nachweisempfindlichkeit erheblich, erfordert aber auch eine sorgfältige Optimierung der Konzentration von Fluorescein-konjugierten Markern. So reicht bereits ein Zehntel der für die Durchflusszytometrie angegebenen Einsatzkonzentration eines Fluorescein-konjugierten CD-Markers, um in einer immunhistochemischen Färbung mit Peroxidase-konjugiertem anti-Fluorescein Antikörper ein deutliches Signal zu erhalten (Abb. 2). Konjugate aus Markerenzymen und anti-Fluorescein Antikörper lassen sich außerdem in ELISAs oder zum Nachweis Fluorescein-markierter Proben auf Blot-Membranen einsetzen.
Abb. 2: Konvertierung von Fluoreszenz in ein lichtmikroskopisch sichtbares Reaktionsprodukt.(A) Mikroglia in autoptischem corticalen Hirngewebe. Umwandlung der relativ schwachen Fluoreszenz-Markierung mit Fluorescein anti-CD45 durch Peroxidase-markierten anti-Fluorescein Antikörper (#200-032-037) und das Chromogen Nickel-verstärktes Diaminobenzidin (DAB). (B) Perineuronale Netze der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Konversion grünfluoreszierender Lektin-Bindungsstellen für Fluorescein-markiertes Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) durch Peroxidase-konjugierten anti-Fluorescein Antikörper (# 200-032-037) und Nickel-verstärktes DAB.
Mit Alexa Fluor 488 oder anderen Grünfarbstoffen markierte anti-Fluorescein Antikörper eignen sich dazu, die Grünfluoreszenz des an einen Antikörper, eine Nukleinsäure oder anderen Biomoleküls gekoppelten Haptens Fluorescein zu verstärken, ohne dessen Fluoreszenzfarbe zu ändern (Abb. 3). Fluorescein-gekoppelte Marker sind bei nachträglicher Amplifizierung in einer höheren Verdünnung einsetzbar als ohne Signalverstärkung. Darüber hinaus ist die Alexa Fluor 488-Fluoreszenz weniger empfindlich gegenüber Fading als die des Fluoresceins.
Abb. 3: Verstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein. Perineurales Netz der extrazellulären Matrix im Neocortex der Ratte. Farbverstärkung der Grünfluoreszenz von Fluorescein-konjugiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) mit grün-markiertem anti-Fluorescein Antikörper (z.B. #200-542-037).
Mit leuchtenden Rotfarbstoffen wie Cy3 markiertes anti-Fluorescein kann genutzt werden, um die Grünfluoreszenz eines Fluorescein-Konjugates in eine photostabile Rot-Fluoreszenz umzuwandeln und dadurch das Signal von Fluorescein-Konjugaten zu verstärken (Abb. 4).
Abb. 4: Umwandlung der Grünfluoreszenz in ein stabil rot fluoreszierendes Signal. Doppelmarkierung eines perineuronalen Netzes der extrazellulären Matrix (rot) und Blutgefäßen (blau) im Ratten-Neocortex. Netzdarstellung mit Fluorescein-markiertem Lektin (Vicia villosa Agglutinin) gefolgt von Cy3-markiertem anti-Fluorescein Antikörper. Gefäßmarkierung mit biotinyliertem Kartoffel-Lektin (Solanum tuberosum Agglutinin) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084).
Gemeinsam mit anti-Digoxin oder anti-Biotin (oder Streptavidin) können anti-Fluorescein-Konjugate für Doppel- und Mehrfachfärbungen mit Hapten-konjugierten Markern eingesetzt werden (Abb. 5). Peroxidase-Konjugate von Antikörpern gegen Haptene ermöglichen in CARD-Nachweissystemen im Zusammenspiel mit Fluoreszenz-markierten Tyramid-Derivaten eine erheblich verbesserte Nachweisempfindlichkeit.
Abb. 5: Hapten-anti-Hapten-Mehrfach-Markierung. Dreifachmarkierung von Gefäßen, perineuronalen Netzen der extrazellulären Matrix und Astroglia im Cortex der Ratte. Die Färbung der Blutgefäße (blau) erfolgte mit biotinyliertem Lektin (Solanum tuberosum) und rot-markiertem Streptavidin (z.B. # 016-600-084). Perineuronale Netze (grün) wurden mit Fluorescein-markiertem Lektin (Wisteria floribunda Agglutinin) und nachfolgend grün-markiertem anti-Fluorescein (z.B. # 200-542-156) dargestellt, während digoxigenyliertes anti-GFAP und Cy3-konjugiertes anti-Digoxin (200-162-156) der Detektion von Astroglia diente.
* Literatur – Anwendungsbeispiele
Abbildungsnachweis: (*1) Alle abgebildeten Präparate stammen von Wolfgang Härtig aus dem Paul-Flechsig-Institut für Hirnforschung (PFI) der Universität Leipzig. Die Abbildungen von Fluoreszenzmarkierungen wurden an einem konfokalen Laserscanningmikroskop (LSM) 510 Meta von Jens Grosche (PFI) angefertigt. (*2) Die Aufnahmen der Immunperoxidase-Markierungen erfolgten durch Uli Gärtner (PFI) an einem Axiophot, ausgestattet mit einer AxioCam HRC sowie dem Programm AxioVision 3.1.2.1.