Der indirekte Nachweis von Maus-Primärantikörpern auf Mausgeweben wird oft durch hohe Hintergrundfärbung erschwert. Das Hauptproblem ist, dass der Anti-Maus Sekundärantikörper bei indirekten Nachweismethoden nicht zwischen endogenen Maus-Immunglobulinen im Probengewebe und dem Maus-Primärantikörper zu unterscheiden vermag.
Endogene Immunglobuline sind hauptsächlich in löslicher Form im interzellulären Raum verteilt und verursachen insbesondere Probleme beim Nachweis von Antigenen, die nahe der Zelloberfläche oder in der extrazellulären Matrix lokalisiert sind.
Darüber hinaus finden sich gewebeeigene Immunglobuline auf der Zelloberfläche von Lymphozyten. Die Höhe des Hintergrunds hängt vom Gewebetyp ab und variiert von Probe zu Probe. Das Problem tritt oft in Geweben aus Muskel, Haut und Niere auf.
Endogene Immunglobuline sind nicht die einzige Ursache für erhöhten Hintergrund bei Maus-auf-Maus Färbungen.
So können u. a. auch endogene Peroxidase-Aktivität im Probengewebe oder Fc-Rezeptoren einen Einfluss haben.Peroxidase-Aktivität kann durch einen Blockierungsschritt vor der Blockierung mit Normalserum oder nach der Primärantikörperinkubation inhibiert werden.
Die Bindung des Sekundärantikörpers an Fc-Rezeptoren von Zellen und Geweben lässt sich einerseits durch eine geeignete Blockierung mit Normalserum oder speziellen Fc-Rezeptor-Blockierungslösungen verhindern. Setzt man Fab(2)-Fragmente als Sekundärantikörper ein, schließt man ein Binden an Fc-Rezeporen komplett aus.
Blockierung endogener Immunglobuline mit Fab-Fragmenten
Eine besonders effiziente Methode, die Hintergrundfärbung endogener Immunglobuline bei indirekten Nachweismethoden zu verhindern, ist die Vorinkubation des Probengewebes mit Fab-Fragmenten unkonjugierter anti-Maus Antikörper. Diese Methode kann ohne weiteres auch auf den indirekten Nachweis (Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, Zytometrie) von Primärantikörpern anderer Spezies auf homologen Geweben und Zellen übertragen werden.
Beispielprotokoll zum Blockieren von endogenen Immunglobulinen mit Fab-Fragmenten auf Mausgewebe.
IHC Antikörper – Maushistologie
IHC-validierte Marker für die Maushistologie – Speziell entwickelt für Formalin-fixiertes Paraffingewebe (FFPE) der Maus!
Antikörper für die Maushistologie
Monovalente Fab-Fragmente zum Blockieren
Fab anti-Maus
Fab anti-Ratte
Fab anti-Human
Fab anti-Kaninchen
Immunhistochemische Färbung von Mausantikörpern auf Rattengewebe
Sekundärantikörper gegen Maus IgG reagieren aufgrund der hohen Homologie zwischen Maus und Ratte mit IgG von Ratte kreuz und können daher unerwünschte Hintergrundmarkierung endogener Ratte-Immunglobuline im Probengewebe verursachen.
Endogene Immunglobuline befinden sich im interzellulären Raum und verursachen insbesondere Probleme beim Nachweis von Antigenen, die nahe der Zelloberfläche oder in der extrazellulären Matrix lokalisiert sind. Die Höhe des Hintergrunds ist vom Gewebetyp und der einzelnen Probe abhängig. Das Problem tritt oft in Geweben aus Muskel, Haut und Niere auf.
Eine Methode, die Hintergrundfärbung endogener Immunglobuline beim indirekten Nachweis von Mausantikörper auf Mausgewebe zu verhindern, finden Sie hier.
Eine einfachere Vorgehensweise zur Verhinderung von Hintergrundfärbung durch gewebeeigene Immunglobuline besteht in der Auswahl von Sekundärantikörpern, bei denen die Kreuzreaktivität gegen die zur Wirtsspezies des Primärantikörpers homologen Spezies minimiert ist (MinX).
Bei der Markierung von Maus-Primärantikörpern auf Rattengeweben sind Anti-Maus MinX Ratte-Sekundärantikörper erforderlich.
Zur Färbung auf Rattengewebe dem Beispielprotokoll folgen, Schritt 7./8. weglassen und in Schritt 11. z. B. Kat-Nr. 115-035-166 einsetzen.Hinweis: Augrund der Adsorption gegen eine eng verwandte Spezies können monoklonale Primärantikörper, die seltenere IgG-Subklassen besitzen (IgG2b, IgG3), teilweise nicht mehr so gut erkannt werden. Die Sensitivität eines gegen Ig einer homologen Spezies adsorbierten Sekundärantikörpers ist vermindert. Dies gilt insbesondere für Anti-Maus (adsorbiert gegen Ratte), Anti-Ratte (adsorbiert gegen Maus) oder Anti-(arm.)Hamster (adsorbiert gegen Maus, Ratte).
Wenn es nicht unbedingt erforderlich ist, Primärantikörper einer Spezies (z.B. Maus) in der Gegenwart einer anderen, eng verwandten Spezies (z.B. Ratte) nachzuweisen, sollte die Wahl eines gegen eng verwandte Spezies adsorbierten Sekundärantikörpers daher vermieden werden.